白皮杉醇抑制內質網應激保護四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷

劉文靜高進賢 錢 倩蒲君峰石 磊吳樹金*

(1.甘肅省人民醫院藥劑科,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學基礎醫學院,甘肅 蘭州 730000)

四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4) 誘導的化學性肝損傷模型被廣泛用于急性肝損傷病理生理學機制研究[1],其主要分子學基礎為CCl4經肝細胞色素P450 酶系代謝為毒性產物三氯甲基自由基() 和過氧化三氯甲基自由基(),這2種高毒性、高反應活性中間體可以損傷DNA 和生物膜,尤其是可以與內質網膜上的磷脂分子發生共價結合,引起脂質過氧化,從而啟動內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS) 這一通路,進而誘導大量肝細胞過度凋亡,尤以中心靜脈周圍區域嚴重,成為CCl4誘導肝損傷的主要病理學改變[2-3]。內質網(endoplasmic reticulum,ER) 是一種存在于真核細胞中的細胞器,主要負責合成、折疊、修飾和轉運蛋白,只有正確的折疊蛋白才能從ER 轉運至高爾基體中,任何干擾氧化還原的調控都能夠導致ERS；活性氧(reactive oxygen species,ROS) 水平過高會明顯誘導內質網中蛋白的錯誤折疊,更為重要的是ERS 又會反過來通過未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR) 以及與線粒體之間的相互作用產生更多的ROS,兩者之間形成負反饋,加速CCl4所致肝損傷,其中ROS成為觸發內質網應激進而介導凋亡通路的關鍵上游信號分子,抗氧化應激則成為打破這一環路保護肝損傷的關鍵所在[4-5]。

目前,臨床治療肝損傷的大多數藥物存在有效性差、不良反應多等問題,故研發療效確切、安全性高的藥物尤為重要。白皮杉醇主要存在于葡萄皮、紅酒中,是多種傳統中草藥的有效成分,也為白藜蘆醇的羥基化類似物[6],但它相比白藜蘆醇具有更強的抗氧化活性,其原因除了含有4 個酚羥基,可以螯合氧自由基外[7],而且可主要通過一種新的蛋白激酶C 和酪氨酸激酶旁路來上調抗氧化酶血紅素加氧酶(heme oxygenase-1,HO-1) 表達,該作用優于姜黃素、槲皮素、大多數均二苯乙烯化合物,從而保護細胞功能[8]。課題組前期發現,基于上調HO-1 抗氧化酶作用的藥物可抑制肝細胞凋亡[9],故本實驗在CCl4誘導的小鼠急性肝損傷模型中觀察白皮杉醇的保護作用,同時探討其機制是否與通過上調HO-1 抗氧化酶、抗氧化應激來抑制內質網應激途徑介導的肝細胞凋亡有關。

1 材料

1.1 儀器 AU2700 型全自動生化分析儀、IX-70型熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；LS-50B 型熒光分光光度計(日本Shimadu 公司)。

1.2 試劑與藥物 白皮杉醇(純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司),臨用時用1.5%DMSO 初溶后,0.9%生理鹽水配制成2 g/L 母液備用；水飛薊素(純度≥98%,成都曼斯特生物科技有限公司)。CCl4為分析純(上海凌峰化學試劑有限公司),臨用時用植物油配成1%溶液；DMSO (上海拜力生物科技有限公司)；SOD、GSH、MDA 檢測試劑盒 (南京建成生物工程研究所)；PERK、ATF4、CHOP、TRB3、caspase-12、β-ACTIN 抗體(美國Santa Cruz Biotechnology 公司)；TUNEL 試劑盒(瑞士Roche 公司)；其余試劑均為分析純。

1.3 動物 60 只SPF 級雄性昆明小鼠,體質量18～22 g,購于甘肅省中醫藥大學實驗動物中心,動物生產許可證號SCXK (甘) 2015-0002。

2 方法與結果

2.1 動物肝損傷模型的制備 參考文獻[10]報道,將60 只雄性昆明小鼠適應性飼養7 d,隨機分為對照組,CCl4組,水飛薊素陽性對照組,低、中、高劑量白皮杉醇保護組,每組10 只。水飛薊素組給予腹腔注射(20 mg/kg),基于白皮杉醇對抗氧化酶HO-1 的作用為時間依賴性,根據以往文獻報道及我們前期預實驗的結果,白皮杉醇保護組分別腹腔注射給予10、20、40 mg/kg,每天1 次、共計7 d[11],對照組、模型組分別腹腔注射等體積生理鹽水。末次給藥1 h 后,對照組小鼠腹腔注射植物油(10 mL/kg),其余組小鼠腹腔注射給予5% CCl4(10 mL/kg) 油溶液。24 h 后小鼠眼眶采血、離心(2 000 r/min,15 min) 取血清-20 ℃凍存待測；解剖取肝臟組織,保存備用。

2.2 統計學分析 采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以表示,多組間比較采用方差分析,病理分級統計數據釆用Mann-Whitney U 檢驗。 P ＜0.05 或P＜0.01 為差異有統計學意義。

2.3 白皮杉醇對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠血清指標的影響 使用全自動生化分析儀檢測AST、ALT、TP、Alb 和A/G 比。由表1 可知,與正常對照組相比,CCl4模型組小鼠血清ALT、AST 值顯著升高(P ＜0.01),TP、Alb、A/G 比明顯降低；不同劑量的白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 和水飛薊素均可有效抑制急性肝損傷小鼠血清ALT、AST 值的增高和TP、Alb、A/G 比的降低 (P ＜0.05,P＜0.01)。

表1 白皮杉醇對CCl4 誘導的急性肝損傷小鼠血清指標的影響（，n=10）Tab.1 Effects of piceatannol on levels of serum indexes of mice with CCl4-induced acute liver injury （，n=10）

注:與對照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,+P＜0.05,++P＜0.01。

2.4 白皮杉醇對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠肝臟病理組織學的影響 取小鼠肝右葉條形組織200 mg,福爾馬林溶液固定24 h、石蠟包埋、切片(厚度為4 μm),常規HE 染色,中性樹脂封片,光鏡下觀察肝組織結構的病理變化。由病理科專業醫師分析鑒定。依據肝損傷程度評分標準[10]:0級,正常肝組織細胞；1 級,肝細胞輕微腫脹,散發炎性細胞浸潤,個別肝細胞壞死；2 級,肝小葉不超過1/3 的局灶或斑塊性肝細胞壞死,聚集性炎性細胞浸潤；3 級,肝小葉1/3 至1/2 的廣泛肝細胞壞死,大量炎性細胞浸潤；4 級,肝小葉超過1/2的肝細胞壞死,廣泛炎性細胞浸潤。

由圖1 可見,對照組小鼠肝細胞結構完整、排列整齊,細胞核大小正常,核質淡染。模型組小鼠大量肝細胞變性腫脹,匯管區可見大量炎性細胞浸潤,肝索排列紊亂,肝細胞脂肪變性,胞漿疏松呈空泡狀,散在凋亡小體。白皮杉醇 (10、20、40 mg/kg) 組和水飛薊素組小鼠變性壞死肝細胞和浸潤的炎癥細胞均不同程度減輕,病理損傷級別降低(表2)。該結果提示白皮杉醇能顯著降低小鼠急性肝損傷程度。

圖1 白皮杉醇對CCl4 誘導的急性肝損傷小鼠的肝臟病理組織學影響（×200）Fig.1 Histopathological analysis of mice with CCl4-induced acute liver injury subjected to piceatannol treatment （×200）

表2 白皮杉醇對CCl4 誘導的急性小鼠肝損傷病理組織學評分影響（n=10）Tab.2 Histopathological grades of mice with CCl4-induced liver injury subjected to piceatannol treatment （n=10）

2.5 白皮杉醇對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響 TUNEL 法檢測肝細胞凋亡。按照試劑盒說明書操作,將肝組織石蠟切片采用二甲苯常規脫蠟,乙醇梯度水化,PBS (pH 7.4) 漂洗3次,每次5 min；加入蛋白酶K 工作液37 ℃反應30 min,PBS 漂洗3× 5 min,4% 多聚甲醛 (pH 7.4 的PBS) 室溫固定30 min,PBS 漂洗3× 5 min,浸入封閉液(3% H2O2) 室溫封閉10 min,PBS 漂洗3× 5 min；樣品上加入適量TUNEL 檢測液,37 ℃避光孵育60 min,PBS 漂洗3× 5 min,去除PBS 液,每張切片加50～100 μL DAPI 染液,室溫避光孵育5 min。PBS 洗3 次,每次5 min。滴加適量的抗熒光淬滅劑于組織上,蓋玻片封片,熒光顯微鏡下使用激發波長450 nm、發射波550 nm 觀察。凋亡細胞由于DNA 斷裂暴露出3’ -羧基末端而被標記為綠色,每張切片隨機選取5 個視野計數凋亡細胞數,實驗結果采用Image Pro plus 6.0 圖像分析軟件進行統計,結果以陽性細胞數/細胞總數×100%表示。

由圖2 可見,與對照組比較,CCl4模型組小鼠肝細胞凋亡顯著增加(P＜0.01),尤其以中心靜脈周圍處明顯,白皮杉醇 (10、20、40 mg/kg)組和水飛薊素組與CCl4模型組比較,細胞凋亡顯著減少(P＜0.05,P＜0.01),且隨白皮杉醇濃度的升高,細胞凋亡明顯下降。

2.6 白皮杉醇對急性肝損傷小鼠肝組織內質網應激信號通路相關蛋白表達的影響[12]取肝組織,裂解液裂解,7 000 r/min 低溫離心10 min,取上清液待測。取80 μg 蛋白,加入上樣緩沖液煮沸變性,10% SDS-PAGE 電泳,將蛋白轉印到PVDF 膜上,5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入相應一抗4 ℃孵育過夜,再加二抗室溫孵育1 h,ECL 顯色,拍照。Gel-Pro analyzer 4.0 軟件分析結果。

內質網應激通路是機體內細胞凋亡的三大重要途徑之一,為了驗證白皮杉醇是否通過抑制ERS保護CCl4所致肝細胞凋亡,本研究采用Western blot 法檢測了ERS 誘導細胞凋亡途徑中的關鍵相關凋亡因子的表達。結果如圖3 所示,與對照組相比,CCl4模型組小鼠肝組織中PERK、ATF4、CHOP 蛋白表達水平顯著增高(P＜0.01)；與模型組相比,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 與水飛薊素均可顯著抑制小鼠肝組織ERS 通路相關蛋白PERK (圖3A)、ATF4 (圖3B)、CHOP (圖3C)的表達(P＜0.01),提示白皮杉醇可能通過內質網PERK-ATF4-CHOP 途徑抑制CCl4所致肝細胞凋亡。

2.7 白皮杉醇對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織TRB3 蛋白表達的影響 CHOP 通路是ERS 誘導細胞凋亡的關鍵環節,為了進一步明確ERS 在白皮杉醇保護肝損傷中的作用,本研究直接檢測了CHOP 的下游靶基因TRB3 的表達。結果如圖4 所示,與對照組相比,CCl4模型組小鼠肝組織中TRB3 蛋白表達水平顯著增高(P＜0.01)；與模型組相比,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 與水飛薊素均可顯著抑制TRB3 的表達(P＜0.01)。

2.8 白皮杉醇對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織caspase-12 蛋白表達的影響 鑒于caspase-12 誘導的細胞凋亡為ERS 特異性的,本研究使用Western blot,進一步檢測了活化形式的cleaved Caspase-12蛋白表達,結果如圖5 所示,與正常對照組相比,CCl4模型組小鼠肝組織中cleaved caspase-12 蛋白表達水平顯著增高(P＜0.01)；與模型組相比,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 與水飛薊素均可顯著抑制cleaved caspase-12 的表達(P＜0.01)。

2.9 白皮杉醇對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、GSH、MDA 的影響 取左前葉肝組織(約0.5 g),冷生理鹽水沖洗,濾紙吸干,稱定質量,剪碎,冰浴勻漿,制成10%組織勻漿,4 000 r/min低溫離心15 min,取上清液待測。按照試劑盒說明書,采用硫代巴比妥酸比色法檢測MDA 含有量,TNB 法檢測GSH 水平,黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

圖2 白皮杉醇對CCl4 誘導的急性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響（×200，，n=10）Fig.2 Hepatic cells apoptosis of mice with CCl4-induced acute liver injury subjected to piceatannol treatment （×200，，n=10）

為了探討白皮杉醇對ERS 抑制的作用機制,本研究檢測了氧化酶系的相關酶含有量表達。由表3 可知,與對照組比較,CCl4模型組小鼠肝組織SOD、GSH 水平明顯降低(P＜0.01),MDA 水平明顯增高(P ＜0.01)；與模型組比較,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 和水飛薊素組可明顯抑制急性肝損傷小鼠肝組織SOD 的降低和MDA 水平的升高(P＜0.01),10 mg/kg 白皮杉醇組與CCl4模型組相比GSH 水平差異無統計學意義(P ＞0.05),20、40 mg/kg 白皮杉醇組與CCl4模型組比較,GSH 水平顯著升高,差異具有統計學意義(P ＜0.01)。

2.10 白皮杉醇對急性肝損傷小鼠肝組織HO-1 蛋白表達的影響 為了明確白皮杉醇抗氧化損傷的機制,本研究使用Western blot 檢測了HO-1 蛋白的表達。結果如圖6 所示,與對照組比較,CCl4模型組小鼠肝組織中HO-1 蛋白表達水平顯著降低(P＜0.01)；與模型組比較,白皮杉醇(10、20、40 mg/kg) 與水飛薊素均可顯著抑制HO-1 的表達(P＜0.01)。

3 討論

CCl4誘導的小鼠急性肝損傷首先體現在血清生化指標的變化,氧化應激時因肝細胞膜脂質化,進而通透性增加,導致大量AST、ALT 從肝臟轉移入血,故AST、ALT 是反映肝損傷最早、最敏感的指標,其升高程度與肝損傷程度呈正相關[13]。本實驗顯示,不同劑量白皮杉醇可明顯抑制CCl4誘導ALT、AST 水平的增高,以及TP、Alb、A/G 比的降低；白皮杉醇保護組肝細胞疏松化程度、炎癥細胞浸潤及脂肪變性情況均有不同程度的緩解,并呈一定的量效關系,并與血清學改變結果相一致,表明該成分可抑制CCl4誘導的肝細胞凋亡。

表3 白皮杉醇對CCl4 致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、GSH、MDA 的影響（，n=10）Tab.3 Effects of piceatannol on hepatic SOD，GSH and MDA levels of mice with CCl4-induced liver injury（，n=10）

表3 白皮杉醇對CCl4 致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、GSH、MDA 的影響（，n=10）Tab.3 Effects of piceatannol on hepatic SOD，GSH and MDA levels of mice with CCl4-induced liver injury（，n=10）

注:與對照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,++P＜0.01。

機體內誘導細胞凋亡的途徑主要為死亡受體、線粒體、ERS,而CCl4經肝細胞色素P450 酶系代謝的毒性產物具有強氧化性,極易與內質網膜磷脂結合,導致錯誤折疊蛋白在內質網腔內聚集,引起ERS,最終誘導肝細胞大量凋亡,故氧化應激與ERS 是CCl4所致肝損傷的中心事件。ERS 誘導細胞凋亡的重要信號分子為CHOP。CHOP 是ERS 特異的轉錄因子,屬于C/EBP 轉錄因子家族成員,其編碼的蛋白參與細胞凋亡過程,在非應激狀態下,表達水平很低,而在ERS 時則大量表達[5,14]。本實驗發現,CCl4可誘導肝細胞CHOP 大量表達,而不同劑量白皮杉醇可顯著抑制CCl4誘導CHOP的表達,提示該成分對CCl4誘導細胞凋亡的抑制作用與ERS 相關。為了進一步探討白皮杉醇對ERS 的作用機制,本實驗檢測了CHOP 上游調控因子PERK、ATF4 的表達,發現ERS 時PERK、ATF6、IRE-1 都能誘 導CHOP 轉錄,但PERKATF4 是CHOP 蛋白表達所必需的,而且是ERS 誘導CHOP 轉錄最重要的一條通路,PERK 信號通路的激活在ERS 早期因抑制蛋白質合成而發揮的是細胞保護作用,但隨著ERS 時間延長,它通過誘導CHOP 的大量表達反而促進細胞凋亡[15-16]。有研究表明[17-18],TRB3 是新鑒定的CHOP 靶基因,ERS 可誘導TRB3 的表達,其表達要晚于CHOP,可能參與了CHOP 誘導的細胞凋亡,本實驗顯示,白皮杉醇可顯著抑制CCl4誘導PERK-ATF4、TRB3的表達,初步驗證了該成分可通過PERK-ATF4-CHOP-TRB3 抑制ERS 誘導的肝細胞的凋亡。

圖4 白皮杉醇對CCl4 致急性肝損傷小鼠肝組織TRB3表達的影響（，n=10）Fig.4 Effect of piceatannol on expression of TRB3 in mice with CCl4-induced acute liver injury （，n=10）

圖5 白皮杉醇對CCl4 致急性肝損傷小鼠肝組織cleaved caspase-12 蛋白表達的影響（，n=10）Fig.5 Effect of piceatannol on expression of cleaved caspase-12 in mice with CCl4-induced acute liver injury （，n=10）

圖6 白皮杉醇對CCl4 致急性肝損傷小鼠肝組織HO-1 表達的影響（，n=10）Fig.6 Effect of piceatannol on expression of hepatic HO-1 of mice with CCl4-induced acute liver injury （，n=10）

同時,本實驗直接檢測了caspase-12 表達,其定位于ER 外膜,是ERS 介導的凋亡特有的關鍵分子,在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化,而ERS 可引起其激活,后者切割并激活caspase-9,進而激活caspase 級聯途徑誘導細胞凋亡[19]。結果,白皮杉醇可以顯著抑制CCl4誘導caspase-12的表達,進一步驗證了該成分保護CCl4誘導的急性肝損傷與其抑制ERS 有關。

在病理情況下,體內氧自由基產生過多或清除不足,過度激活的氧自由基可引起肝細胞膜、線粒體膜、溶酶體膜發生脂質過氧化反應,產生脂質過氧化物及其降解產物(MDA),進一步加重細胞膜損傷,最終引起肝細胞的結構和功能障礙[20-21],血清SOD 活性和GSH 含有量是肝臟中最有效的抗氧化劑,可提高肝臟解毒能力、消除自由基、保護細胞膜結構和功能完整[22-23]。為了探討白皮杉醇抑制ERS 的作用機制,本研究檢測了肝組織相關抗氧化酶及脂質化合物的水平,發現該成分可明顯升高GSH、SOD 水平,同時降低MDA 水平,減輕氧化應激反應。

SOD、GSH、MDA 水平主要間接反映了白皮杉醇對機體抗氧化能力的改變,為了進一步明確該成分的抗氧化作用機制,本實驗直接檢測了肝組織HO-1 的表達。結果顯示,白皮杉醇可顯著改善CCl4對HO-1 的下調作用,可能是通過一種新的蛋白激酶C 和酪氨酸激酶旁路來上調抗氧化酶血紅素加氧酶(HO-1) 的表達,亦有相關報道通過激活NRF2 進而誘導HO-1 的表達[8],尚需進一步實驗來證實。

綜上所述,白皮杉醇對CCl4誘導急性肝損傷具有一定的保護作用,其機制可能與該成分上調HO-1、抑制ERS 介導的肝細胞凋亡有關。鑒于白皮杉醇相比其他均二苯乙烯化合物有著更優的藥理作用,而且基于HO-1 靶點的相關藥物被越來越多地應用于臨床相關疾病的診療中,本實驗可為該成分在化學性肝損傷中的應用提供了一定的依據,而且基于其對HO-1 的強效作用,也能為考察HO-1是否是化學性肝損傷的關鍵干預靶點提供依據。