中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌誘導THP-1 細胞炎癥因子表達的抑制作用

魏 靜 孫培冬 *

(1.江南大學化學與材料工程學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學合成與生物膠體教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

痤瘡是發生于皮脂腺內的一種慢性炎癥性疾病,痤瘡的產生與痤瘡丙酸桿菌的活動密切相關[1]。最近的研究發現痤瘡丙酸桿菌不僅可引起皮膚炎癥,由它釋放的外膜囊泡更可造成強烈炎癥[2],因此,盡管抗菌藥物抑制了細菌生長,但外膜囊泡的存在仍使炎癥不能根除,目前尚未見抑制痤瘡丙酸桿菌外膜囊泡釋放的藥物的報道。此外,由于痤瘡常反復發作,長期使用抗菌藥物或激素藥物治療痤瘡,易出現細菌耐藥、藥物依賴等不良后果[3]。所以,在有效的抑菌的同時,減少外膜囊泡的釋放,是緩解或治愈痤瘡的正確途徑。本研究以苦參、當歸、金銀花、荷葉、艾葉為原料,測定其乙醇提取物和水提取物的抗菌、抑制外膜囊泡釋放的性能,尋找可以抑制細菌生長并同時抑制外膜囊泡釋放的中藥提取物組合,進而通過體外細胞實驗,檢測炎癥因子,以抑制炎癥反應的程度評價中藥提取物防治痤瘡的效果。

1 材料

1.1 藥材 苦參、當歸、金銀花、荷葉、艾葉均購于無錫市市民大藥房,其中苦參、當歸、金銀花、荷葉、艾葉分別產自山西、甘肅、河南、山東、江蘇。由江南大學趙炳天、劉學副教授鑒定,苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Alt.的根；當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis (Oliv.)Diels 的根；金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的花蕾；荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的葉；艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl.et Van.的葉。

1.2 儀器 Tecan Infinite 200 PRO 多功能酶標儀(上海帝肯國際貿易有限公司)；UV-1800PC 紫外分光光度計(翱藝儀器有限公司)；BIONOON-10A真空冷凍干燥機(上海般諾生物科技有限公司)；AX224ZH/E 電子天平 (奧豪斯儀器有限公司)；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；FS-2 電熱培養箱(南通滬南科學儀器有限公司)；Centrifuge 5804R 離心機(艾本德中國有限公司)；CP70ME 超速離心機(日本株式會社日立制作所)；S-4800 掃描電子顯微鏡(日本株式會社日立制作所)。

1.3 試劑 胰蛋白胨(國藥集團化學試劑有限公司,批號20181218)；酵母浸膏(國藥集團化學試劑有限公司,批號20171205)；牛肉浸膏(國藥集團化學試劑有限公司,批號20180131)；瓊脂粉(國藥集團化學試劑有限公司,批號20181122)；D (+) -無水葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司,批號20180926)； L-半胱氨酸鹽酸鹽(國藥集團化學試劑有限公司,批號20170928)；可溶性淀粉 (國藥集團化學試劑有限公司,批號20180528)；氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司,批號20180509)；無水乙酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司,批號20180808)；RPMI1640 培養基(美國Hyclone 公司,批號AE24464298)；胎牛血 清 (澳大利 亞 Ausgenex 公 司,批號FBSSA00616-1)；人腫瘤 壞死因 子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α,批號350751)、人白細胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β,批號296222)、人白細胞介素-8 (interleukin-8,IL-8,批號297753) ELISA 試劑盒購自美國Novus Biologicals公司；CCK-8 試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號091918190314)；BCA 試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號010719190225)。

2 方法

2.1 中藥提取物制備 5 種中藥粉碎后各稱取10 g,100 mL 乙醇或水回流提取2 次,1.5 h/次,得藥材的乙醇或水提取液。將提取液旋蒸至干,冷凍干燥,得中藥提取物。稱定質量,計算得率。提取物存放于4 ℃冰箱中備用。

2.2 細菌培養和炎癥刺激物制備 牛肉浸膏10.0 g,酵母浸膏3.0 g,胰蛋白胨10.0 g,無水葡萄糖5.0 g,氯化鈉5.0 g,無水乙酸鈉3.0 g,可溶性淀粉1.0 g,半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g,瓊脂粉18.0 g,去離子水1 000 mL,配制成溶液,用2%NaOH 調pH 至6.8,用高壓滅菌鍋121 ℃下滅菌20 min。將培養基倒入培養皿中,冷卻凝固,制成固體培養基。液體培養基配制時不加瓊脂粉,其余同固體培養基。

將痤瘡丙酸桿菌接種于液體培養基,37 ℃無氧培養直至OD600nm為1.0,即對數生長期,得菌懸液。菌懸液在5 000 g、4 ℃下離心15 min,得培養物上清液和細菌沉淀。細菌沉淀用磷酸緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS) 洗滌3 次,然后懸浮在PBS 中,置于80 ℃水浴中30 min 以實現熱滅活,制成痤瘡丙酸桿菌滅活物,4 ℃保存備用[4]。將培養物上清液用100-KDa 纖維膜超濾濃縮30 倍,用0.22 μm 孔徑的過濾器過濾,濾液在150 000 g、4 ℃下離心3 h,除去上清液,用PBS 洗滌3 次,最后懸浮于PBS 中,制成外膜囊泡液,-80 ℃保存備用[5]。將外膜囊泡液附載在硅片上用白熾燈烤干,噴金后用掃描電鏡觀察形貌；用納米粒度儀測定外膜囊泡粒徑。用BCA 試劑盒結合酶標儀,以吸光度法測定蛋白標準曲線及外膜囊泡蛋白質量濃度[6]。

2.3 中藥提取物的抑菌活性

2.3.1 牛津杯法測抑菌圈 用比濁法調整菌懸液濃度,使細菌濃度約在1×107cfu/mL。向固體培養基上加1 mL 菌懸液并用無菌三角玻璃刮鏟涂布均勻。用鑷子夾取牛津杯置于涂布菌懸液的固體培養基,輕壓牛津杯使之與培養基接觸良好。在牛津杯中分別加入100 μL 100 mg/mL 的各提取物溶液,其中水提取物溶劑為水,乙醇提取物溶劑為0.5%DMSO 溶液,以各自溶劑為空白對照組[7]。將培養皿放入自封袋中,并在自封袋中放入厭氧產氣包,置于恒溫培養箱中37 ℃培養48 h,用游標卡尺量取抑菌透明圈的直徑,按下式計算抑菌圈直徑。抑菌圈直徑=抑菌透明圈的直徑(mm) -牛津杯的外徑(mm)

2.3.2 最小抑菌濃度實驗 取各提取物溶液100 μL加入96 孔板中,并在每孔中加入100 μL 菌懸液,使藥物終質量濃度為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 mg/mL,細菌濃度約在1×107cfu/mL,37 ℃厭氧培養48 h。96 孔板每孔取150 μL 培養液涂布于固體培養基,取無細菌生長的質量濃度為最小抑菌濃度[8]。

2.3.3 中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌生長曲線的影響 將中藥提取物溶于含有0.5% DMSO 的液體培養基配制成溶液,加5 mL 于試管中,再向試管中加入5 mL 菌懸液,使中藥提取物終質量濃度為10 μg/mL,細菌濃度為1×107cfu/mL。每隔6 h 用紫外分光光度計測1 次菌懸液在600 nm 處吸光度值,以吸光度值與培養時間的關系繪制細菌生長曲線[9]。不加中藥提取物的含有0.5% DMSO 的液體培養基作為空白對照組。

2.4 中藥提取物對外膜囊泡釋放的抑制作用 用含有10 μg/mL 中藥提取物的液體培養基,37 ℃、5% CO2條件下培養痤瘡丙酸桿菌至對數生長期,水提取物溶劑為水,乙醇提取物溶劑為0.5%DMSO 溶液,以各自溶劑為空白對照組。用“2.2”項下方法分離各實驗組和空白對照組外膜囊泡,用BCA 試劑盒測定外膜囊泡蛋白質濃度。

2.5 藥物組合的抗炎作用

2.5.1 痤瘡丙酸桿菌和外膜囊泡與炎癥的關系用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基調整THP-1細胞濃度為1×106/mL,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養至對數生長期,接種于12 孔板,調整細胞濃度為1×106/mL,分別用10 μg/mL 的痤瘡丙酸桿菌滅活物、外膜囊泡刺激細胞,以不加炎癥刺激物為空白對照組,培養24 h,用ELISA 試劑盒檢測細胞培養上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α 水平。

2.5.2 藥物組合對THP-1 細胞炎癥因子的抑制作用 將THP-1 細胞接種于96 孔板中,用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基調整THP-1 細胞濃度為2.5×106/mL,分別加入100、50、25、12.5、6.3、3.1 μg/mL 的中藥提取物溶液,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h,用CCK-8 試劑盒測細胞活力。以不加中藥提取物的空白組的細胞活力為100%。THP-1 細胞接種于6 孔板,調整細胞濃度為1×106/mL,加入痤瘡丙酸桿菌、無細胞毒性的中藥提取物培養24 h。用ELISA 試劑盒檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-8 水平。以不加中藥提取物及痤瘡丙酸桿菌為空白對照組,以不加中藥提取物但加入痤瘡丙酸桿菌為模型組。

2.6 統計學分析 取3 次重復實驗結果,通過Prism7.0 軟件對數據進行處理,數據以() 表示,組間比較采用單因素方差分析,以P≤0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 中藥提取物得率 如表1 所示,各中藥的水提取物得率均高于乙醇提取物,且乙醇提取物為粉末狀態,水提取物為干浸膏狀態,原因是水提取物中通常含有較多的蛋白質和多糖類成分。

表1 中藥提取物得率Tab.1 Several Chinese herbal medicine extracts yield

3.2 痤瘡丙酸桿菌外膜囊泡的制備與檢測

3.2.1 SEM 及納米粒度儀測試 由圖1A 可以看出外膜囊泡呈球體,直徑約為150 nm 左右。如圖1B 顯示,由納米粒度儀測得外膜囊泡粒徑約為120～160 nm,平均粒徑為149.6 nm,結果與SEM圖像吻合。而痤瘡丙酸桿菌的粒徑為(1～10) μm×(0.5～1.5) μm,可以判斷已成功將外膜囊泡與痤瘡丙酸桿菌分離。

圖1 外膜囊泡的粒徑Fig.1 OMVs particle sizes

3.2.2 BCA 法測外膜囊泡蛋白濃度 測得蛋白質濃度在0～500 μg/mL 時與吸光值間的線性關系符合回歸方程Y=9.39×10-4X+0.122 (R2=0.998),其中X 為蛋白濃度,Y 為吸光度值。將外膜囊泡液稀釋4 倍后用BCA 試劑盒檢測,取3 次平行實驗的平均值,吸光度值為0.247±0.006,代入標準曲線計算得外膜囊泡液蛋白濃度為(532.01±24.19)μg/mL。

3.3 中藥提取物的抑菌活性 由表2 可知空白對照組的抑菌圈為0 mm,證明溶劑無抑菌活性,對中藥提取物的抑菌效果無干擾。提取物中除當歸水提物對痤瘡丙酸桿菌無抑菌活性外,其余提取物都有一定的抑菌活性,苦參的乙醇提取物抑菌效果最好,抑菌圈為(14.35±0.64) mm。除荷葉外,水提物的抑菌活性均低于乙醇提取物,因為水提物中常含有的蛋白質及多糖類成分,有助于細菌的生長,減弱了提取物的抑菌活性。

表2 中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈直徑（，n=3）Tab.2 The diameter of the inhibition zone of several Chinese herbal medicine extracts against P.acnes （，n=3）

表2 中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈直徑（，n=3）Tab.2 The diameter of the inhibition zone of several Chinese herbal medicine extracts against P.acnes （，n=3）

注:與空白對照組比較,**P＜0.01。

由表3 可知苦參乙醇提取物的抑菌效果遠遠好于其它提取物,其最小抑菌濃度為0.2 mg/mL。10 μg/mL苦參乙醇提取物對痤瘡丙酸桿菌生長曲線的影響如圖2 所示,與未加提取物的空白對照組相比,苦參乙醇提取物在極低濃度時依然存在抑菌作用,24、48 h 抑菌率分別為60%、30%。

3.4 中藥提取物對外膜囊泡釋放的抑制作用 外膜囊泡液蛋白濃度為 (532.01±24.19) μg/mL,由圖3A 可知金銀花乙醇提取物、荷葉乙醇提取物對外膜囊泡的釋放無抑制作用?？鄥⒁掖继崛∥?、苦參水提取物、當歸乙醇提取物、當歸水提取物、金銀花水提取物、荷葉水提取物具有弱抑制作用,抑制效果小于60%。艾葉乙醇提取物、艾葉水提取物有強抑制作用,艾葉乙醇提取物抑制效果最好。由圖3B 可以看出艾葉乙醇提取物對外膜囊泡釋放的抑制作用呈現劑量依賴性,10 μg/mL 艾葉乙醇提取物溶液對外膜囊泡的抑制率約為95%。因此,將具有抑制痤瘡丙酸桿菌生長作用的苦參乙醇提取物和具有抑制外膜囊泡釋放作用的艾葉乙醇提取物組合,作為抗炎作用提取物進行進一步研究。

表3 中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度Tab.3 Minimum inhibitory concentration of several Chinese herbal medicine extracts on P.acnes

圖2 中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌生長曲線的影響Fig.2 Effects of several Chinese herbal medicine extracts on P.acnes growth curve

3.5 藥物組合的抗炎作用

3.5.1 痤瘡丙酸桿菌和外膜囊泡與炎癥的關系由圖4 可知痤瘡丙酸桿菌滅活物和外膜囊泡均可誘導THP-1 細胞炎癥因子的表達,與相同蛋白質濃度的痤瘡丙酸桿菌滅活物相比外膜囊泡引起THP-1細胞炎癥因子表達的能力更強?？梢?痤瘡丙酸桿菌可通過本身毒素及釋放外膜囊泡誘導THP-1 細胞的炎癥因子表達?？捎灭畀彵釛U菌和THP-1細胞共培養的方式評價中藥提取物的抗炎功效。

圖3 中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌釋放外膜囊泡的抑制作用Fig.3 The inhibitory effects of several Chinese herbal medicine extracts on the release of P.acnes OMVs

圖4 痤瘡丙酸桿菌滅活物和外膜囊泡誘導THP-1 細胞IL-1β、IL-8、TNF-α 表達Fig.4 Expression of IL-1β，IL-8，TNF-α in THP-1 cells induced by inactivated P.acnes and its OMVs

3.5.2 提取物組合抑制痤瘡炎癥的作用 由圖5可知,隨著提取物質量濃度增大,細胞存活率隨之降低,細胞毒性隨之增大,取細胞活力≥90%的質量濃度為無細胞毒性濃度[10]。10 μg/mL 苦參乙醇提取物和10 μg/mL 艾葉乙醇提取物中細胞存活率分別為90%、93%,提取物達20 μg/mL 時細胞存活率僅有60%左右,因此當提取物質量濃度高于10 μg/mL 時具有潛在的毒性風險?？鄥⒁掖继崛∥?艾葉乙醇提取物組合的曲線表示了等質量濃度下苦參乙醇提取物與艾葉乙醇提取物的組合,10 μg/mL苦參乙醇提取物+10 μg/mL 艾葉乙醇提取物的組合雖然提取物總質量濃度為20 μg/mL,但細胞存活率與10 μg/mL 苦參乙醇提取物、10 μg/mL艾葉乙醇提取物相近,均為90% 左右,無細胞毒性。

圖5 苦參乙醇提取物、艾葉乙醇提取物及其組合對THP-1細胞存活率的影響Fig.5 Effects of ethanol extracts from Sophora flavescens，Artemisia argyi and their combinative use on the survival rate of THP-1 cells

用10 μg/mL 苦參乙醇提取物、10 μg/mL 艾葉乙醇提取物和10 μg/mL 苦參乙醇提取物+10 μg/mL艾葉乙醇提取物組合加入痤瘡丙酸桿菌和THP-1細胞共培養體系中,測得苦參乙醇提取物、艾葉乙醇提取物、苦參乙醇提取物+艾葉乙醇提取物對THP-1 細胞炎癥因子的抑制作用如圖6 所示。相對于苦參乙醇提取物和艾葉乙醇提取物,苦參乙醇提取物+艾葉乙醇提取物組合增強了對于IL-1β、TNF-α 表達的抑制；且對IL-8 的表達抑制,增強效果更加明顯。表明苦參乙醇提取物抑菌和艾葉乙醇提取物抑制外膜囊泡釋放的共同作用發揮了更好的抗炎功效。

圖6 苦參乙醇提取物、艾葉乙醇提取物及其組合的抗炎作用Fig.6 Anti-inflammatory effects of ethanol extract from Sophora flavescens，Artemisia argyi and their combinative use

4 討論

痤瘡丙酸桿菌是造成痤瘡的重要原因,這一觀點已被證實；但痤瘡丙酸桿菌誘導痤瘡產生的機理還不十分明確。在痤瘡治療方面,已經做了大量針對抑制痤瘡丙酸桿菌生長和繁殖的工作,但效果并不理想[11]。根據文獻報道[2],本實驗驗證了痤瘡丙酸桿菌本身的毒素和它釋放出的外膜囊泡均能導致炎癥因子表達的升高,而且外膜囊泡的致炎效果更強。外膜囊泡是細菌的一種外泌體,對于革蘭氏陰性菌外泌體的報道可以追溯到1963 年[12],而在2009 年才發現革蘭氏陽性菌同樣可以產生外泌體[13]。對革蘭氏陽性菌外泌體的研究才剛剛起步,痤瘡丙酸桿菌作為一種革蘭氏陽性菌,抑制其外泌體的釋放可能是痤瘡治療的新思路。

因此,為了抑制痤瘡炎癥在抑制痤瘡丙酸桿菌的同時更應考慮抑制細菌外膜囊泡的釋放,由此本文研究了苦參、當歸、金銀花、荷葉、艾葉乙醇和水提取物的抗菌作用及抑制細菌外膜囊泡釋放的作用,以找到對2 個因素共同作用起到抗痤瘡炎癥效果的中藥提取物組合。本實驗發現苦參乙醇提取物和艾葉乙醇提取物的組合可以起到抑制痤瘡丙酸桿菌和抑制細菌釋放外膜囊泡的功效,同時在不增加細胞的毒性的情況下,起到相比于單個提取物更好的抑制痤瘡炎癥效果。組合中苦參乙醇提取物抑菌效果顯著,對痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈為(14.35±0.64) mm,最小抑菌濃度為0.20 mg/mL,從細菌的生長曲線可以看出10 μg/mL 苦參乙醇提取物仍具有抑菌作用。艾葉乙醇提取物具有抑制外膜囊泡釋放的作用,抑制作用呈現劑量依賴性,10 μg/mL時抑制效果達95%左右。10 μg/mL 苦參乙醇提取物、10 μg/mL 艾葉乙醇提取物、10 μg/mL 苦參乙醇提取物+10 μg/mL 艾葉乙醇提取物中細胞存活率分別約為90%、93%、90%,均無細胞毒性。因此苦參乙醇提取物和艾葉乙醇提取物的組合在痤瘡預防和治療方面有很好的應用前景。