基于網絡藥理學探討肝復樂防治原發性肝癌的作用機制

潘 宇 徐 菲 龔 輝吳芳芳陳 路曾楊麗李 娟蔣益蘭*李順祥*

(1.湖南中醫藥大學,湖南 長沙 410208;2.廣西壯族自治區藥用植物園,廣西 南寧 530023;3.西南瀕危藥材資源開發國家工程實驗室,廣西 南寧 530023;4.湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心,湖南 長沙 410208;5.湖南中醫藥大學附屬中西醫結合醫院,湖南 長沙 410006)

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一,復發轉移率、致死率較高[1-2],急需挖掘復方中藥對肝癌的潛在治療價值。肝復樂是國家名中醫潘敏求教授經多年臨床觀察潛心研究而發明的國家級抗癌三類新藥,治療中晚期肝癌的療效顯著[3-6],但該方治療肝癌發揮作用的藥效物質基礎、作用機制與作用靶點的國內外相關研究較少。課題組的前期網絡藥理學試驗初步證實[7],磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha,PIK3CA)、半胱氨酸蛋白酶8 (caspase-8,CASP8) 是肝復樂治療肝癌的病理網絡中的關鍵調控靶點,并且能影響PI3K-Akt/mTOR/JAkt-STAT/Wnt 等信號傳導通路,前人研究[8-9]發現這4 條關鍵信號傳導通路與肝癌的凋亡、增殖、轉移、侵襲浸潤等病理機制密切相關。本文觀察肝復樂對人肝癌HepG-2 細胞的增殖、遷移和侵襲以及PIK3CA、CASP8 蛋白表達的影響,并與網絡藥理學的研究結果進行驗證對比研究。

1 材料

1.1 儀器 RE-5205 型旋轉蒸發儀(鄭州鞏義予華儀器有限責任公司)；BSA124S-CW 電子天平(上海滬粵明科學儀器有限公司)；BP211D 型萬分之一天平(德國Sartorius 公司)；SK3300H 型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；H1850離心機(上海趙迪儀器有限公司)；680 型酶標儀(美國Bio-Rad 試劑公司)；CO2恒溫培養箱(日本SANYO 公司)；754N 型紫外可見光分光光度計(上海天翔光學儀器有限公司)；LX71 倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；PowerPac 系列電泳儀(美國Corning costar 公司)。

1.2 藥物 肝復樂原生藥材內的所有小分子化合物搜集來源于中草藥在線數據庫(TCM-ID、TCM Database@taiwan)。肝復樂21 味中藥材飲片[清熱解毒組(茵陳、敗醬草、半枝蓮、重樓)、健脾理氣組 (黨參、炒白術、黃芪、茯苓、薏苡仁、制香附、陳皮、柴胡、沉香、川木通)、活血化瘀組(醋鱉甲、土鱉蟲、桃仁、蘇木、生牡蠣、郁金、大黃) ]均由湖南國華制藥廠提供,經湖南中醫藥大學藥學院劉塔斯教授鑒定為正品,均符合2020 年版《中國藥典》 一部各藥材項下要求；鹽酸阿霉素 (浙江海正藥業股份有限公司,批號86904641000828,規格100 mg)；肝復樂清熱解毒組、活血化瘀組、健脾理氣組、肝復樂全方組4 個醇溶部位；用磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 溶解,保存于-20 ℃備用,使用前用無血清培養基稀釋至所需濃度。

1.3 細胞株 人肝癌細胞株HepG-2 (中南大學湘雅三醫院,批號XY-H0203),采用含10% Gibco胎牛血清(FBS) (上海栩冉生物科技有限公司,批號172000-023) 改良,RPMI-1640 培養基常規培養。

1.4 試劑 PIK3CA 一抗(美國CST 公司,批號KL412265)；山羊抗兔IgG 二抗(Goat Anti-Rabbit IgG/HRP Antibody) (美國KPL 公司,批號SC-2301)；CCK-8 檢測試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司,批號250120512)；Transwell 試劑盒(美國BD Bioscience 公司,批號B190125)；蛋白質定量試劑盒 (美國 Invitrogen 公司,批號L181230)；ECL 化學發光試劑盒(美國Pierce 公司,批號P170450)；96 細胞培養板(美國Corning costar 公司,批號C160353)。

1.5 數據庫和軟件 CambrigeSoft ChemOffice 2012(http://www.cambridgesoft.com/),Discovery Studio 2.55 (http://accelrys.com/),Cytoscape 3.7 (http://www.cytoscape.org/)。

2 方法

2.1 網絡藥理學構建多成分-多靶點-多途徑-多疾病的相互作用模型 首先,從TCM-ID (http://www.megabionet.org/tcmid/)、TCM Database@taiwan (http://tcm.cmu.edu.tw/) 中草藥數據庫歸納整理974 個小分子化合物,并從ChemSpider(http://www.chemspider.com) 下載小分子2D&3D 的MOL 分子結構。然后,從OMIM (http://www.omim.org/) 獲取8 個原發性肝癌靶標(AXIN1[10]、CASP8[11]、CTNNB1[12]、TP53[13]、PDGFRL[14]、APC[15]、PIK3CA[16]和MET[17],靶標蛋白信息見表1),靶點之間的相互關系利用String (http://string-db.org/) 在線分析；運用Discovery Studio 2.55 軟件中口服生物利用度(OB)、類藥性(DL) 作為篩選條件,設置OB≥30%、DL≥0.01,為了進一步篩選潛在活性較高的小分子化合物,繼續預測上述篩選后的726個小分子化合物的代謝性質(ADME,吸收、分布、代謝、排泄),設置生物篩選指標(人體腸道吸收,6.1 ＜ALop ＜ 9.6、25 ℃；水中溶解度,-4.0＜log (Sw) ＜-2.0；穿透血腦屏障,-0.52 ＜BBB＜0.0),逐步篩選出198 個具有潛在抗肝癌活性的小分子,對初步篩選后的小分子化合物與上述的8 個原發性肝癌靶標進行分子對接運算,在Discovery Studio 2.55 利用“Ligand Docking” (配體快速對接) 協議對這些優化后的小分子化合物與靶點蛋白進行分子對接,運用 binding energy、libdockscore、ligscore-1、ligscore-2、PLP-1和ligscore PLP-2 等多個打分函數進行一致性打分,選取親和力最好的配體,篩選出69 個可能具有潛在活性最強的小分子化合物。分別從KEGG (http://www.genome.jp)、OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 獲取肝癌靶點相關的113 條生物作用途徑；利用Cytoscape3.7 (http://www.cytoscape.org/) 軟件建立“藥物-化合物-靶點-途徑-疾病” 的復雜網絡相互作用關系模型直觀圖。

表1 原發性肝癌靶標蛋白Tab.1 Target protein of HCC

2.2 肝復樂藥材提取制備 肝復樂全方藥材以及3 個功效拆方組藥材的溶劑提取法采用專利技術嚴格制備[18-20],各藥材配伍量比關系嚴格按照其方法進行等比例配伍組方,并根據實驗室的實際條件,改進提取工藝。肝復樂上述藥材的含有量測定嚴格采用2010 年版《中國藥典》 方法進行測定。肝復樂醇溶部位配制成1 g/mL 的母液,臨用前用培養液稀釋1 000 倍,使其終濃度小于0.1%。

2.3 細胞培養 人肝癌細胞株HepG-2 采用含10% FBS 改良,RPMI-1640 細胞培養基常規培養,于5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養箱中培養,細胞貼壁生長,根據細胞生長狀態更換新的培養基,待細胞融合度達90%時,用0.25%的胰蛋白酶消化傳代,取對數生長期細胞用于實驗。

2.4 分組 實驗設置空白對照組、阿霉素組(2 μg/mL),肝復樂清熱解毒組(醇溶部位)、肝復樂活血化瘀組(醇溶部位)、肝復樂健脾理氣組(醇溶部位)、肝復樂全方組(醇溶部位) 4 個藥物組,并分別設置低質量濃度組(2.5 μg/mL)、中質量濃度組(5 μg/mL)、高質量濃度組(10 μg/mL)。

2.5 CCK-8 法檢測HepG-2 細胞的增殖影響 取生長良好的對數生長期HepG-2 細胞,接種于96 孔板進行細胞培養。將HepG-2 細胞按“2.4” 項下分組,加入0.1% 二甲基亞砜培養液進行培養,每組設置3 個復孔,培養24、48 h,往各孔細胞中緩慢滴入10 μL CCK-8 溶液,使用細胞酶標儀測定450 nm處的吸光度(OD),計算各組細胞增殖抑制率=(1-OD給藥組/OD空白對照組) ×100%。

2.6 Transwell 法檢測HepG-2 細胞的遷移能力HepG-2 細胞按“2.4” 項下分組,孵育24 h,常規消化,調整細胞濃度為3×105/mL；Transwell 小室中分別接種細胞200 μL,然后下室加入500 μL 10% FBS 的RPMI-1640 細胞培養基,孵育24 h；使用倒置熒光顯微鏡,觀察附著于小室底膜下表面的細胞形態；在450 nm 波長處,使用酶標儀檢測OD,并間接計算遷移的細胞數目。細胞遷移率=(空白對照組遷移細胞數-給藥組遷移細胞數)/空白對照組遷移細胞數) ×100%。

2.7 Transwell 法檢測HepG-2 細胞的侵襲能力制備Transwell 小室,細胞分組同“2.4” 項下,將各組細胞常規消化,室溫孵育,調整細胞濃度為1×105/mL,Transwell 下室加入800 μL 含有15%FBS 的DMEM 細胞培養基；孵育48 h 后用倒置顯微鏡(200 倍) 觀察穿過聚酯纖維膜的細胞,每組隨機選取3 個不同的視野進行細胞計數。細胞侵襲率=(1-給藥組穿膜細胞數目/空白對照組穿膜細胞數目) ×100%。

2.8 Western blot 法檢測CASP8、PIK3CA 蛋白表達 實驗按“2.4” 項下分組,收集各組處理后48 h的HepG-2 細胞,裂解10 min,提取細胞中總蛋白。使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒對蛋白進行定量,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,以半干法轉膜,將一抗用5%脫脂牛奶稀釋至適當濃度,二抗用10×TBST 緩沖液稀釋至適當濃度,室溫下孵育1～2 h 后,洗滌3 次,進行化學發光反應,配置ECL 發光液,育膜5 min,顯影、曝光。采用QuantityOne 軟件分析,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 標化,用凝膠圖像處理系統進行灰度值分析。

2.9 統計學處理 采用SPSS19.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料以() 表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗；不符合正態性,組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗；方差不齊時,多組間均數比較采用Dunnett T3 檢驗。以P≤0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 網絡藥理學構建多成分-多靶點-多途徑-多疾病的相互作用模型 網絡相互作用關系模型圖拓撲參數分析表明(圖1),槲皮素(quercetin) (相鄰連接度=292.6,節點度=6)、β-谷甾醇(β-sitosterol) (相鄰連接度=363.8,節點度=6)、香草醛(vanilline) (相鄰連接度=111.2,節點度=4)、蒿素C (artemisin C) (相鄰連接度=243.5,節點度=4)、丁香酮 (eugenone)(相鄰連接度=290.8,節點度=5)、D-檸檬烯(d-limonene) (相鄰連接度=196.4,節點度=4)、芳樟醇(linalool)(相鄰連接度=143.1,節點度=3)、咖啡酸(caffeic acid) (相鄰連接度=138.2,節點度=4)和癸酸(capric acid) (相鄰連接度=123.4,節點度=3) 等活性成分比其他成分共享更多的靶點,可能在體內的多靶點生物網絡中調控更多的核心生物通路(癌癥通路、癌細胞凋亡通路、病毒致癌通路和內部免疫調節通路等),Toll-like receptor/JAkt-STAT/PI3K-Akt/信號通路處于核心節點位置。肝癌靶 標 CASP8、PIK3CA、CTNNB1、AXIN1、TP53 是肝復樂21 味藥材共享連接的核心靶點,活性分子若與某些疾病靶點相關,則可能對靶點相關的疾病具有潛在治療作用[10-12]。C 型肝炎、B 型肝炎、結腸癌和乳腺癌處于疾病網絡關鍵節點,揭示肝復樂極有可能對這些癌癥具有潛在的臨床治療作用。肝復樂理氣健脾組比清熱解毒組、活血化瘀組含有更多數量藥材與活性成分,并通過多靶點影響多條生物途徑發揮療效。茵陳(yinchen) (相鄰連接度=846.2,節點度=21)、柴胡(chaihu) (相鄰連接度=580.8,節點度=14)、黃芪(huangqi)(相鄰連接度=361.6,節點度=6)、沉香(chenxiang) (相鄰連接度=128.3,節點度=5)、黨參(dangshen) (相鄰連接度=246.3,節點度=10)、大黃(dahuang) (相鄰連接度=132.1,節點度=19)、白術(baishu) (相鄰連接度=133.6,節點度=5)這7 味藥材網絡節點比其它藥材網絡節點體現更好的拓撲學性質(圖2),揭示這7 味藥材極有可能組成新的優化精簡組方,可對該方的活性成分進行深入研究,提高肝復樂治療肝癌的臨床效果。

圖1 肝復樂功效拆方組-藥材-成分-靶點-靶點-生物途徑-疾病網絡Fig.1 Fuctional group-herbal medicine-ingredients-targetstargets-biological pathways-disease network of GFL

圖2 肝復樂功效拆方組-藥材-成分-靶點-靶點Fig.2 Fuctional group-herbal medicine-ingredients-targets-targets network of GFL

3.2 人肝癌HepG-2 細胞形態學觀察 將2.5、5、10 μg/mL (低、中、高質量濃度組) 的肝復樂4個醇溶部位分別作用于HepG-2 細胞48 h 后,空白對照組細胞形態均發生變化,細胞貼壁能力下降,可見核固縮、核碎裂和核溶解。當藥物濃度逐漸升高,細胞形態變化愈加明顯,貼壁細胞數目占細胞總數的比例逐漸減小(圖3)。

3.3 肝復樂對HepG-2 細胞的增殖影響 如圖4 所示,藥物處理HepG-2 細胞24、48 h 后,5 μg/mL肝復樂全方組、肝復樂健脾理氣組細胞抑制率高于5 μg/mL 肝復樂清熱解毒組、肝復樂活血化瘀組(P＜0.05)；2.5 μg/mL 肝復樂全方組處理HepG-2細胞24 h 細胞增殖抑制率高于2.5 μg/mL 肝復樂功效拆方組(P＜0.05),但是處理48 h,肝復樂各濃度組細胞抑制增殖率并無明顯差異(P＞0.05)。給藥48 h 后,10 μg/mL 肝復樂健脾理氣組抑制HepG-2 細胞增殖抑制率高于10 μg/mL 其他藥物組(P＜0.05),由此可見,給藥48 h 后,肝復樂全方中、高質量濃度組對HepG-2 細胞抑制比較明顯,因此作為后續細胞遷移、侵襲與蛋白表達影響實驗作用濃度。

圖3 肝復樂醇溶部位作用HepG-2 細胞48 h 對細胞形態的影響（×200）Fig.3 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on morphological changes of HepG-2 cells in 48 h （×200）

圖4 肝復樂醇溶部位對HepG-2 細胞增殖的影響（×200，n=3）Fig.4 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on proliferation of HepG-2 cells （×200，n=3）

3.4 肝復樂對HepG-2 細胞的遷移影響 給藥48 h后,與空白對照組比較,肝復樂功效拆方組無細胞遷移抑制作用(P＞0.05),肝復樂全方組、阿霉素組抑制細胞遷移(P＜0.05)。與阿霉素組相比,5、10 μg/mL 肝復樂全方組干預的HepG 細胞視野中不同透膜細胞數目相對略多,細胞間隙略大,疊加生長的細胞數目略多,說明阿霉素組抑制肝癌細胞遷移能力略強于肝復樂全方組,肝復樂全方組細胞遷移率差異無統計學意義(P＞0.05)；肝復樂3 個功效拆方組細胞遷移率降低(P＜0.05)。見表2、圖5。

3.5 肝復樂對HepG-2 細胞的侵襲影響 給藥處理HepG-2 細胞48 h 后,隨著藥物濃度的增加,視野中透膜的細胞數目逐漸減少,細胞形態逐漸變為圓形或橢圓形,細胞間隙也逐漸增大。與空白對照組比較,肝復樂全方組、阿霉素組能抑制人肝癌HepG-2 細胞的侵襲(P＜0.05)。5 μg/mL 肝復樂3個功效拆方組細胞穿膜數目相對5 μg/mL 肝復樂全方組減少(P＜0.05),說明肝復樂全方中濃度組對細胞侵襲能力的抑制作用明顯強于肝復樂功效拆方中濃度組。見表3、圖6。

表2 肝復樂醇溶部位對HepG-2 細胞遷移能力的影響（，n=3）Tab.2 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on migration of HepG-2 cells （，n=3）

表2 肝復樂醇溶部位對HepG-2 細胞遷移能力的影響（，n=3）Tab.2 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on migration of HepG-2 cells （，n=3）

注:與空白對照組比較,▲P＜0.05；與阿霉素組比較,#P＜0.05。

表3 肝復樂醇溶部位對HepG-2 細胞侵襲能力的影響（，n=3）Tab.3 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on invasion of HepG-2 cells （，n=3）

表3 肝復樂醇溶部位對HepG-2 細胞侵襲能力的影響（，n=3）Tab.3 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on invasion of HepG-2 cells （，n=3）

注:與空白對照組比較,▲P ＜0.05；與全方中質量濃度組比較,△P＜0.05；與阿霉素組比較,#P＜0.05。

圖5 肝復樂醇溶部位對HepG-2 細胞遷移的影響（×200）Fig.5 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on migration of HepG-2 cells （×200）

圖6 肝復樂醇溶部位對HepG-2 細胞的侵襲影響（×200，n=3）Fig.6 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on invasion of HepG-2 cells （×200，n=3）

3.6 肝復樂對HepG-2 細胞的CASP8、PIK3CA 蛋白表達的影響 與空白對照組比較,肝復樂全方及功效拆方組作用于HepG-2 細胞48 h 后,CASP8、PIK3CA 蛋白表達降低(P＜0.05)；與阿霉素組比較,10 μg/mL 肝復樂健脾組、全方組CASP8、PIK3CA 蛋白表達下調(P＜0.05),但在肝復樂清熱組、活血組蛋白表達,差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖7。

4 討論

圖7 肝復樂對HepG-2 細胞的CASP8、PIK3CA 蛋白表達的影響（n=3）Fig.7 Effects of Ganfule on expression of CASP8 and PIK3CA related proteins of HepG-2 cell （n=3）

前期網絡藥理學實驗表明[7],肝復樂是通過多成分、多靶點、多途徑來調控疾病病理網絡重新恢復機體平衡。揮發油類,比如香草醛、蒿素C、丁香酚、D-檸檬烯、咖啡酸單體化合物可能是抗肝癌活性具有最明顯效果的活性組分,需要未來的藥理實 驗進一 步驗證。CASP8、PIK3CA、CTNNB1、AXIN1、TP53 是肝復樂21 味藥材共享連接的肝癌核心靶標,這些靶標可作為下一步的測試體外肝癌細胞內驗證靶點蛋白的表達水平。核心靶標與PI3K-Akt/mTOR/JAkt-STAT/Wnt 信號傳導通路密切相關,肝復樂的抗肝癌作用機理很有可能是能通過CASP8、PIK3CA 核心靶標調節這4 個信號傳導通路。文獻報道[21-23]這4 個信號通路與常見惡性腫瘤增殖病理機理密切相關,比如肝細胞癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、結腸癌與乳腺癌。網絡藥理學揭示肝復樂可能對胰腺癌、結腸癌、非小細胞肺癌、人類T 淋巴細胞白血病、病毒I 型感染等疾病具有治療作用,這需要進一步的臨床試驗加以驗證。

肝復樂全方組能明顯抑制HepG-2 細胞遷移能力和侵襲能力,幾乎等同于阿霉素的干預效果(P＞0.05)。肝復樂3 個功效拆方組與全方組相比,對HepG-2 細胞遷移能力及侵襲能力并無明顯抑制作用。分別用中質量濃度組(5 μg/mL)、高質量濃度組(10 μg/mL),在相同時間(48 h) 處理HepG-2 細胞,相互比較3 個功效拆方組抑制HepG-2 細胞的遷移與侵襲影響,結果并無統計學差異(P＞0.05),推測肝復樂3 個功效組可能對HepG-2 細胞并無明顯的遷移與侵襲影響。上述實驗表明肝復樂健脾理氣組通過提高人體的免疫能力來發揮抗肝癌的功效,可能并不是通過干預癌細胞遷移、侵襲的作用途徑,也許是通過抑制癌細胞血管內皮生長因子、誘導癌細胞凋亡等其他機制發揮療效。本實驗的結果具有一定的局限性,這需要開展后續相關實驗進行證實。另外推測,肝復樂功效拆方組的藥物濃度或者作用時間,可能并未達到具備干預影響效應的臨界值,需要提高濃度或者延長作用時間,此初步結論尚需進一步的研究探討。

觀察肝復樂不同濃度的藥物組作用于PIK3CA、CASP8 蛋白的表達影響,本實驗結果分析,與對照組比較,肝復樂全方組以及3 個功效拆方組均能明顯調控PIK3CA、CASP8 蛋白的表達(P＜0.05),并且調控水平隨濃度增加而增強。與阿霉素組相比,肝復樂全方組、健脾理氣組的調控水平差異具有統計學意義(P＜0.05),但是,肝復樂清熱解毒組、活血化瘀組,均無統計學差異(P＞0.05)。此結果揭示,肝復樂全方組可能通過對HepG-2 細胞的增殖、遷移與侵襲相關的致癌關鍵因子PIK3CA、CASP8 靶點蛋白的影響,來調控PI3K/Akt/JAkt-STAT/Wnt 信號傳導通路。并進一步證實了肝復樂全方組的配伍效果以及臨床療效明顯優于清熱解毒組、活血化瘀組與健脾理氣組,這一結論與前期實驗結果比較吻合,進一步加強了網絡藥理學的結論的可靠性與真實性,并與肝復樂的發明人潘敏求教授的實驗結果保持一致。

肝復樂全方組調控PIK3CA、CASP8 蛋白的表達,比清熱解毒組、活血化瘀組、健脾理氣組等3個功效拆方組更具明顯差異。肝復樂健脾理氣組調控PIK3CA、CASP8 蛋白的表達比清熱解毒組、活血化瘀組更加明顯。結果揭示肝復樂可能是通過調控PIK3CA、CASP8 蛋白表達,間接干預PI3KAkt/mTOR/JAkt-STAT/Wnt 等信號傳導通路。體外細胞株的實驗結果并不能完全代替人體肝癌發病機制,本實驗在HepG-2 細胞株上的細胞和蛋白的觀察情況,是否在人體肝癌中具有相同效應仍不確定。另外PIK3CA、CASP8 靶點蛋白對HepG-2 細胞基因表達譜影響的作用機制尚不明確,需要今后進一步深入研究。