冰片對血腦屏障通透性影響機制的研究進展

張英睿,王 建,董泰瑋,陳 念,胡瓊丹,樊亞梅

(成都中醫藥大學藥學院,四川 成都 611137)

冰片商品有3 種,分別是龍腦香科植物龍腦香Dipterocarpus turbinatus Gaertn.f.樹脂的加工品,即天然冰片；源于菊科植物艾納香Blumea balsamifera (L.) DC.葉提取的結晶,即艾片；以樟腦、松節油等為原料,經化學方法合成的精制品[1],即合成冰片,均收載于2020 版《中國藥典》,其味辛、苦,性微寒或涼,有開竅醒腦、清熱止痛之效[2],冰片常作為佐藥以引藥上行。冰片芳香走竄,能開啟閉阻心竅,因心主神明,腦為元神之府,心與腦息息相關[3],故其配伍應用在心腦血管病治療中尤為廣泛。

血腦屏障是彼此緊密相連的腦毛細血管內皮細胞,與周圍的星形膠質細胞和周細胞相互作用形成的屏障系統,結構[4]見圖1。其中,腦毛細血管內皮細胞之間的緊密連接是大分子物質經血腦屏障轉運的屏障[4],可選擇性允許所需營養物質進入屏障,阻止某些大分子物質進入腦組織,從而保持中樞神經系統內環境的相對穩定,但這也限制了大多數藥物到達患處并發揮治療作用,成為藥物治療中樞神經系統疾病的重要制約因素[5]。

現代藥理研究表明[6],冰片可增加生理性血腦屏障通透性,促使其他藥物通過其而引藥上行,同時也可降低已損傷腦組織的血腦屏障通透性,起到保護腦缺血再灌注后其結構的作用[7]。由此可見,冰片可發揮雙向調節血腦屏障通透性的作用。

汪宏錦等[8]研究表明,天然冰片、艾片、合成冰片主要成分(分別為右旋龍腦、左旋龍腦、異龍腦) 對血腦屏障通透性的作用方向一致,并且其劑量不同,影響血腦屏障通透性的作用強度也有所差異。冰片對血腦屏障通透性作用方向的影響因素主要有2 點,分別為腦組織的生理病理狀態、冰片的臨床用法(單用或配伍),以下將對其進行概述。

圖1 血腦屏障結構示意圖

1 冰片對生理狀態血腦屏障通透性的影響

1.1 增加生理性血腦屏障通透性 冰片不僅具有開竅醒神的功效,而且性善走竄,引藥上行。王寧生等[9]應用CT動態掃描技術,首次提出冰片引藥上行、佐使有功等作用的發揮可能與其能增加生理性血腦屏障通透性有關；現代藥理研究顯示[10],冰片可促進生理性血腦屏障開放,而且不會引起腦的病理性損害,并對腦及血腦屏障有一定的保護作用。

1.1.1 單用促透增量 李偉榮等[11]發現,小鼠灌服天然冰片5 min 后腦內即可測得其所含成分含有量,表明灌胃給藥后它自身可直接透過血腦屏障迅速入腦,發揮促透作用。Wu 等[12]報道,相較于對照組(灌胃給予生理鹽水),灌胃給予等量天然冰片后小鼠腦內尼莫地平含有量顯著升高,AUC5～60min提高30%,提示冰片可促進生理性血腦屏障開放,引藥上行。俞浩等[13]研究表明,小鼠尾靜脈注射羅丹明123(Rh123) 5 min 后,合成冰片高劑量組(200 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg) 與溶劑對照組相比腦組織內該染料含有量顯著升高,同時低劑量組(50 mg/kg) 也有升高趨勢,表明冰片增加血腦屏障通透性作用與其劑量呈正相關。

1.1.2 配伍促透他藥 陳振振等[14]發現,艾片配伍各劑量麝香酮均可提高血腦屏障體外模型的細胞膜流動性,降低細胞膜電位,調節細胞內Ca2+含有量,從而促進梔子苷進入腦部,表明兩者配伍具有芳香開竅的作用,可促進生理性血腦屏障開放。黃萍等[15]報道,合成冰片與安息香配伍時可顯著增加小鼠腦組織中伊文思藍(EB) 含有量,增強開竅醒神的功效。陳群[16]研究表明,低劑量合成冰片(300 mg/kg) 與丹皮酚聯用后小鼠腦組織中后者含有量高于高劑量冰片(600 mg/kg) 聯用合用組,與俞浩等[13]結論相悖,具體有待進一步研究。

1.2 機制研究

1.2.1 增加NO 水平 NO 作為擴血管因子之一,可改善局部神經元的氧供應和微循環,調節腦毛細血管內皮細胞通透性[17],舒張腦血管,是影響血腦屏障通透性的信使分子,通常相關研究是通過考察一氧化氮合酶(NOS) 間接進行的,其中內皮型一氧化氮合酶(eNOS) 在生理條件下存在并發揮生理效應。趙保勝等[18]研究表明,合成冰片可誘導eNOS 表達增強,促使腦毛細血管內皮細胞生成更多的NO,從而介導血腦屏障開放。

1.2.2 影響組胺水平 組胺是一類具有廣泛生物活性的單胺類神經遞質,同時也是機體重要的信息傳遞物質,存在于神經元及組胺能神經纖維中,腦內其水平升高時可增加血腦屏障通透性。Li 等[19]發現,合成冰片可升高大鼠下丘腦內組胺水平,從而介導血腦屏障開放,但該作用具有一定飽和性。曹陽[20]報道,相較于空白組、伊立替康單用組,不同劑量合成冰片聯用伊立替康后大鼠腦內組胺水平均明顯上升,血腦屏障通透性增加。研究表明,組胺誘發血腦屏障通透性增加由NO 介導,這也是生理狀態下它調節微血管通透性的機制之一[21-22],具體見圖2。

圖2 組胺與NO 的關系

1.2.3 抑制P-糖蛋白表達 P-糖蛋白是具有藥物外排泵功能的糖蛋白,在血腦屏障處主要分布于腦毛細血管膜的腔面上,其外排作用對藥物的腦部轉運具有重要意義,可單向將特定藥物排出到腦微血管腔內,阻止其向中樞分布,發揮屏障作用[23]。若同時存在2 種親和力不同的底物,則均可與P-糖蛋白發生競爭性結合,而且親和力大者易與其結合而被泵出細胞膜外,親和力小者則易在細胞內蓄積[24]。

陳振興[25]應用細胞流式儀和蛋白質免疫印跡法,對P-糖蛋白表達、轉運活性等方面進行機制研究,發現天然冰片、艾片、合成冰片均能影響其表達,抑制其轉運活性,而且艾片作用更強。朱國棟[26]研究表明,合成冰片不能抑制大鼠腦組織中P-糖蛋白表達,但其作用與相關競爭性抑制劑維拉帕米相似,推測冰片可能發揮競爭性抑制作用而優先與P-糖蛋白結合,從而抑制不易于透過血腦屏障的藥物外排而在細胞內聚集,介導血腦屏障開放[27]。

1.2.4 影響5-羥色胺水平 5-羥色胺是重要的血管活性物質,也是中樞及外周神經系統的重要神經遞質,其水平變化對血腦屏障通透性有重要影響。Li 等[19]發現,合成冰片可通過升高大鼠下丘腦5-羥色胺來介導血腦屏障開放,而且其作用持久性與劑量有關。王剛等[28]報道,帕羅西汀聯合槲皮素組與合成冰片聯合槲皮素組的作用效果有明顯差異,表明帕羅西汀作為5-羥色胺抑制劑能顯著抑制槲皮素透過血腦屏障,而合成冰片可通過升高大鼠下丘腦5-羥色胺水平可促使血腦屏障開放,從而促進槲皮素透過血腦屏障,使腦組織中其水平顯著增加。

但冰片升高5-羥色胺水平的具體機制尚不明確。有研究表明,5-羥色胺拮抗劑是研究P-糖蛋白功能的有力工具[29],故推測冰片升高其水平的機制可能與P-糖蛋白有關。冰片相較于5-羥色胺,對P-糖蛋白的親和力更大,與后者結合后被泵出細胞外,抑制了兩者結合后外排,使5-羥色胺在細胞內蓄積,從而介導血腦屏障開放[24,30]。

1.2.5 改變血腦屏障超微結構 血腦屏障通透性升高時,常表現為血腦屏障緊密連接的開放、基底膜的疏松斷裂、內皮細胞的間隙加大。陳怡君[31]通過電鏡觀察發現,天然冰片可致血腦屏障超微結構疏松,從而增加血腦屏障通透性。葛朝莉等[24]在透射電鏡下發現與對照組比較,合成冰片組大鼠腦毛細血管內皮細胞間的緊密連接縫隙變寬,結構減少,提示冰片可使血腦屏障超微結構發生改變,介導血腦屏障開放。

Claudin-5 蛋白是血腦屏障緊密連接膜蛋白,僅需其表達即可形成緊密連接,對維持血腦屏障的正常形態與功能意義重大。Jin 等[32]發現,灌胃給予合成冰片30 min 后,Claudin-5 蛋白從腦毛細血管內皮細胞膜轉移至細胞質,緊密連接結構也隨之改變,揭示了冰片改變血腦屏障超微結構的機制之一。

2 冰片對病理狀態血腦屏障通透性的影響

2.1 可降低病理性血腦屏障通透性 研究表明,血腦屏障破壞是腦缺血、腦梗塞等中樞神經系統疾病的重要病理基礎[4]。在病理狀態下,腦毛細血管內皮細胞、星形膠質細胞發生損傷,前者緊密連接開放,后者足端腫脹[33],血腦屏障通透性顯著增加,導致某些大分子物質可通過血腦屏障,而冰片可降低血腦屏障通透性,恢復其正常功能,從而起到修復腦損傷、保護腦組織的作用。

2.1.1 單用 文靜[34]發現,天然冰片、合成冰片可改善永久性大腦中動脈栓塞(pMCAO) 模型大鼠的腦毛細血管超微形態結構,與假手術組相似,表明兩者對受損神經元及血腦屏障結構具有一定的修復作用。田徽[35]報道,艾片、合成冰片中的龍腦可迅速透過局灶性腦缺血(MCAO)大鼠血腦屏障,改善其緊密連接的破壞程度,從而降低其通透性以發揮調節作用,同時證實艾片透過率略高于合成冰片,而且其療效有優于同劑量合成冰片的趨勢。

2.1.2 配伍 徐露等[36]研究天然冰片配伍燈盞花素后腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性的影響,發現與模型組比較,兩者配伍后伊文思藍含有量顯著降低,表明血腦屏障通透性降低,從而得到了保護。楊筱倩[37]等報道,艾片配伍黃芪甲苷、三七總皂苷后,相較于單用可增強對大鼠腦缺血再灌注后腦組織的保護作用。姚洪武等[38]考察了合成冰片、麝香及其兩者不同配比對缺血性模型小鼠血腦屏障通透性的影響,發現與模型組相比,冰片-麝香2∶1、3∶1配伍組腦內伊文思藍含有量顯著降低,以前者更明顯,提示兩者合理配伍能降低腦缺血狀態下血腦屏障通透性。

另外,以麝香、冰片為主的復方麝香注射液有腦保護作用,兩者配伍可通過降低腦含水量、血腦屏障通透性來保護腦組織免受損傷[39]。喻斌等[40]研究表明,合成冰片與川芎配伍對血腦屏障通透性的降低作用及對腦缺血大鼠的保護作用均優于單用川芎,并且中劑量冰片配伍組(160 mg/kg) 療效優于低劑量(80 mg/kg)、高劑量(320 mg/kg),表明兩者配伍對腦缺血的保護作用并非隨冰片劑量增加而增強,可能與血腦屏障狀態、冰片的臨床用法密切相關。

2.2 機制研究

2.2.1 下調NO 水平 NO 作用具有雙重性[41],前者來源于誘導型一氧化氮合酶(iNOS) 的NO 具有神經毒性作用,在病理性因素的刺激下其大量表達,生成的NO 因自身毒性或與超氧化自由基結合得到毒性更大的O2-和OHOO-,使血腦屏障通透性病理性增加,導致神經損傷。由此可知,iNOS 參與了血腦屏障的病理性損傷過程。

田徽[35]報道,艾片、合成冰片均可有效降低大鼠腦缺血再灌注損傷后iNOS 表達,從而抑制iNOS 催化合成NO,降低大量NO 所致的神經毒性,減輕腦損傷,使血腦屏障通透性降低,發揮腦保護作用。王瑋[42]也發現,合成冰片可減少腦損傷大鼠腦微血管中iNOS 表達,減輕過量NO 所致的病理性損傷,進而起到保護腦組織的作用。

2.2.2 抗炎 基質金屬蛋白酶(MMP) 幾乎能降解血腦屏障基底膜胞外基質的各種蛋白成分,使血腦屏障受損,其中與血腦屏障破壞最為密切的是MMP-9,其表達僅與炎癥細胞有關。例如,TNF-α 可上調MMPs 表達,從而加重血腦屏障損傷。

王建等[43]研究表明,MCAO 大鼠與假手術組比較,腦組織MMP-9 表達顯著,給予天然冰片可下調其表達,從而發揮腦保護作用。徐攀[44]發現,給予艾片后抗炎活性藥效指數ETNF-α不斷升高。倪彩霞等[45]研究四味芳香開竅藥對腦缺血再灌注損傷模型大鼠血清TNF-α 水平的影響,發現合成冰片組與5%吐溫對照組比較,TNF-α 水平顯著降低,提示冰片可抑制其水平、生成、釋放,從而發揮一定的抗腦缺血作用。

2.2.3 抗自由基損傷 腦組織中各種氧自由基能通過攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸來引發脂質過氧化作用,形成脂質過氧化物[如丙二醛(MDA) ],同時降低超氧化物歧化酶(SOD) 活性及其清除氧自由基的功能。因此,組織內MDA 水平和SOD 活性可反映細胞受自由基損傷的程度。

邵新然[46]發現,天然冰片可使腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織中SOD 活性上調,增強其清除氧自由基的功能。田徽[35]報道,MCAO 大鼠缺血側腦組織中MDA 水平顯著上升,SOD 活性顯著下降,表明大鼠術后腦組織受損嚴重,而艾片、合成冰片可增強機體清除自由基的能力,有效改善自由基損傷程度,從而起到腦保護作用。

2.2.4 影響相關基因表達 細胞凋亡促進基因Bax、細胞凋亡抑制基因Bcl-2 屬于Bcl-2 基因家族,兩者均與細胞凋亡密切相關,其中前者過度表達產物可拮抗Bcl-2 抑制細胞凋亡的作用,使細胞趨于死亡。研究表明[47],Bax、Bcl-2與腦缺血時發生的細胞凋亡存在因果關系,由于后者表達量低于前者,導致兩者比值升高,最終造成細胞凋亡,血腦屏障破壞,從而誘發腦缺血。 Claudins 基因的表達產物是構成緊密連接復合體的主要成分,其表達下調可導致血腦屏障緊密連接疏松,故它具有重要的調節血腦屏障通透性的作用[31,48]。

Dong 等[49]發現,與腦缺血模型組比較,天然冰片、艾片、合成冰片均可顯著促進Bcl-2 基因表達,其中合成冰片還可顯著降低Bax 表達,天然冰片、合成冰片均可顯著降低Bax/Bcl-2 比值,減輕血腦屏障受損程度。現代藥理研究表明,Bcl-2 表達產物可通過抑制脂質過氧化反應來抑制細胞凋亡,降低血腦屏障通透性[50]；Dong 等[49]也發現與腦缺血模型組比較,天然冰片、艾片、合成冰片均可上調Claudin-5 表達,腦毛細血管內皮細胞、毛細血管基底膜、神經膠質細胞間的連接更緊密,從而降低血腦屏障通透性,發揮腦保護作用。王建[43]等報道,天然冰片配伍紅花可通過促進Claudin-5 表達來發揮對腦缺血損傷的保護作用。

3 討論

冰片可雙向調節血腦屏障通透性,不僅增加生理性血腦屏障通透性,引藥上行,還降低腦組織受損時血腦屏障通透性,發揮腦保護作用,并且促進、抑制血腦屏障開放的機制完全不同。其中,冰片增加血腦屏障通透性的機制主要涉及NO、組胺、P-糖蛋白、5-羥色胺水平及超微結構,各機制之間相互影響,如NO 是介導組胺增加血管通透性的重要物質,冰片與P-糖蛋白結合促使5-羥色胺在細胞內含量增加。冰片降低血腦屏障通透性的作用主要與NO水平、炎癥因子、自由基及基因表達有關,而且不同基因的表達可對血腦屏障超微結構、抗自由基損傷能力產生影響,可見腦組織處于不同生理病理狀態時,NO 水平是影響冰片對血腦屏障作用方向的重要因素,而冰片可通過控制其水平來雙向調節血腦屏障通透性,具體見圖3。

圖3 冰片雙向調節血腦屏障通透性機制

課題組前期對艾片、合成冰片影響血腦屏障的機制和腦保護作用進行了研究,發現給予兩者后MCAO 大鼠血腦屏障的破壞減輕,緊密連接完整,腦水腫改善,水腫率下降,而且艾片高、低劑量組及合成冰片高劑量組可顯著增加斷頭小鼠張口次數、延長存活時間,艾片、合成冰片高劑量組均能顯著延長腹腔注射亞硝酸鈉、尾靜脈注射氯化鎂、雙側頸總動脈結扎所致腦缺血小鼠的存活時間,從而發揮腦保護作用。由此推測,其作用機制可能主要與調節NO 通路、P-糖蛋白通路、抗自由基損傷有關。

雖然3 種冰片對血腦屏障通透性的作用強度無顯著性差異,但艾片在調節血腦屏障通透性的作用機制、腦保護等方面有優于天然冰片、合成冰片的趨勢[25,35],但目前對天然冰片、艾片的研究相對不足,有待進一步考察。不同劑量冰片對血腦屏障通透性的作用也有所差異,綜合俞浩[13]、陳群[16]、喻斌[40]實驗結果,推測它可能與冰片劑量在一定范圍內呈正相關,并存在最佳劑量 (可能為200 mg/kg),此時冰片增加或降低血腦屏障通透性的作用最強,但超過最佳劑量后反而呈負相關,具體還應結合其配伍狀況及腦組織生理病理狀態進行深入研究。

隨著中醫藥現代化的進一步推進,有別于傳統給藥形式的冰片現代應用研究已取得豐碩成果。冰片配伍電針的針藥結合療法[51]、載藥透過血腦屏障的冰片-聚乙二醇共修飾固體脂質納米粒[52]、具有潛在腦靶向作用的丹參素冰片酯[53]等均不同程度地擴大了該藥材的應用范圍,尤其是經過表面修飾的功能化納米粒,在腦靶向遞藥及診斷、腦部疾病治療方面的應用愈加廣泛。

綜上所述,今后對冰片的研究應在選擇適宜品種和劑量的基礎上,結合該藥材影響血腦屏障通透性的相應機制,圍繞它治療現代腦病的作用靶點進行,以期實現其傳統功效與現代制劑(尤其是靶向制劑) 的有機結合。