順式曲札茋苷的制備及其熱穩定性、抗凝血酶活性

張曉蕾 郭明里 黃 茜龔云麒李 寧*陳云建*張建文楊兆祥

(1.昆藥集團股份有限公司,云南 昆明 650100;2.昆明醫科大學藥學院,云南 昆明 650500;3.大理大學藥學與化學學院,云南 大理 671000)

曲札茋苷(白皮杉醇-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷) 是從我國西藏特有植物拉薩大黃Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao 中提取得到的活性成分[1-2],為茋苷(二苯乙烯苷)類化合物,其結構中2 個苯環之間存在1 個雙鍵,故理論上存在順式、反式2 種異構體(圖1)。由于反式異構體在熱力學上較順式穩定,以往研究中獲得的均為前者,故不考慮構型,以曲札茋苷指代反式曲札茋苷。

圖1 順式、反式曲札茋苷結構

研究表明,曲札茋苷在心腦血管[2-3]、神經系統[4]、呼吸系統[5]、消化系統[6]、腫瘤[7]等諸多重大疾病領域中有著廣闊的應用前景。昆藥集團股份有限公司對其進行了持續的考察,在云南麗江引種栽培了拉薩大黃[8],對其質量進行了較為系統的研究[9],建立了該藥材中曲札茋苷的工業化提取純化工藝[10],可大規模制備純度98%以上者[11]。同時,在此基礎上開發了注射用曲札茋苷,以期形成具有我國自主知識產權的天然創新藥物。

雜質是藥物質量研究的重要組成部分,注射用曲札茋苷中該類成分能否被全面、準確地控制直接關系到其有效性與安全性。前期發現,注射用曲札茋苷中的雜質大部分是拉薩大黃原有成分,隨著工藝過程進入成品,但有少量并非來源于原藥材。在工藝及貯存過程中,經強烈日光照射后的原料藥、中間體、制劑中反式曲札茋苷含有量明顯降低,雜質譜也發生較大的變化。理論上,光照可誘導二苯乙烯類化合物順反異構化,電子首先受光照從基態激發到激發態,再經過無輻射躍遷返回分子基態,導致分子可從反式轉化為順式,或從順式變為反式[12],故順式曲札茋苷是注射用曲札茋苷中潛在的雜質。

近年來,有采用光化學反應制備高純度二苯乙烯苷類化合物順式異構體的研究[13],但尚無關于順式曲札茋苷的報道。因此,本實驗通過光化學反應將反式曲札茋苷轉化為順式后,對其進行分離純化及結構鑒定,并考察其熱穩定性及抗凝血酶活性,以期為進一步相關研發提供理論依據與技術支持。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀(配置在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、VWD 檢測器)、Agilent QTOF 6540 質譜儀(美國安捷倫公司)；Avance 800 MHz 核磁共振儀(德國Bruker 公司)；CP225D 分析天平(德國賽多利斯公司)；XPE26 分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q 超純水機(美國Millipore 公司)；ZF-6 紫外燈(上海嘉鵬科技有限公司)；Buchi R-3 旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)；ED-IE-50 凍干機(上海比郎儀器有限公司)；HS-25 PH 計(丹佛儀器有限公司)；Synergy HT 酶標儀(美國BioTek 公司)；IMS-70 全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司)；Eppendorf 移液器(德國Sartorius 公司)。

1.2 試劑與藥物 反式曲札茋苷對照品(純度≥99.0%)及原料藥(批號20140104、20140104-UV-1、20140104-UV-2、20140104-UV-3) (昆藥集團股份有限公司自制)。人凝血酶 (美國Hyphen 公司,Vial of 10 NIH)；熒光底物thrombin substrate 2 (FR-2) Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (加拿大Biomatik 公司)。阿加曲班(湖北鑫源順醫藥化工有限公司,純度≥99%)。色譜純乙腈(德國默克公司)；色譜純乙醇(賽默飛世爾科技有限公司)；氘代甲醇(美國Sigma-Aldrich 公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris,美國Amresco 公司,純度≥99.9%)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 順式曲札茋苷制備 稱取反式曲札茋苷對照品150 mg,置于200 mL 玻璃燒杯中,加入100 mL 甲醇充分溶解,將燒杯敞口置于紫外燈下,以365 nm 紫外光照射4 h,反應后的溶液在35 ℃以下減壓濃縮至2 mL,濃縮液通過HPLC 法分離純化。色譜條件為Phenomenex Luna Su C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相95%乙醇-水(30∶70)；柱溫20 ℃；檢測波長319 nm；進樣量50 μL；目標峰(順式曲札茋苷) 保留時間約16 min。收集目標峰洗脫液,立即以氮氣吹掃揮去乙醇,于黑暗環境中冷凍干燥,合并凍干粉,即得(20 mg)。

2.2 結構鑒定

2.2.1 順式曲札茋 白色粉末(乙醇-水),溶于甲醇、乙醇、乙腈中。UV (乙腈-水) λmax:285 nm。HRESI-MS m/z:405.119 8[M-H]-(計算值405.119 1),分子式C20H22O9。1HNMR (800 MHz,CD3OD) δ:7.21 (1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),6.81 (1H,dd,J=8.0,1.6 Hz,H-6′),6.72 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.39 (1H,d,J=12.0 Hz,H-β),6.34(1H,d,J=12.0 Hz,H-α),6.24 (2H,d,J=1.6 Hz,H-2,6),6.14 (1H,t,J=1.6 Hz,H-4),4.47 (1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.72 (1H,dd,J=12.0,3.2 Hz,H-6″a),3.60(1H,dd,J=12.0,2.4 Hz,H-6″b),3.49 (1H,m,H-2″),3.41 (2H,m,H-3″,5″),3.10 (1H,m,H-4″)；13C-NMR(200 MHz,CD3OD) δ:141.3 (C-1),108.2 (C-2,6),159.5 (C-3,5),102.6 (C-4),130.7 (C-1′),116.5 (C-2′),146.4 (C-3′),147.4 (C-4′),118.4 (C-5′),126.1 (C-6′),129.4 (C-α),130.3 (C-β),104.3 (C-1″),74.8 (C-2″),77.4 (C-3″),70.4 (C-4″),77.4 (C-5″),61.6 (C-6″)。

2.2.2 反式曲札茋 淡黃色粉末(乙醇-水),溶于甲醇、乙醇、乙腈中。UV (乙腈-水) λmax:319 nm。HRESI-MS m/z:405.119 3 [M-H]-(計算值405.119 1),分子式C20H22O9。1H-NMR (800 MHz,CD3OD) δ:7.45 (1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),7.06 (1H,dd,J=8.0,1.6 Hz,H-6′),6.81 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.93 (1H,d,J=16.0 Hz,H-β),6.84 (1H,d,J=16.0 Hz,H-α),6.45 (2H,d,J=2.4 Hz,H-2,6),6.16 (1H,t,J=2.4 Hz,H-4),4.80(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.95 (1H,dd,J=12.0,2.4 Hz,H-6″a),3.73 (1H,dd,J=12.0,5.6 Hz,H-6″b),3.51(1H,m,H-2″),3.49 (2H,m,H-3″,5″),3.39 (1H,t,J=8.8 Hz,H-4″)；13C-NMR (200 MHz,CD3OD) δ:141.6 (C-1),106.4 (C-2,6),160.1 (C-3,5),103.3 (C-4),131.8(C-1′),117.1 (C-2′),147.5 (C-3′),148.7 (C-4′),117.7(C-5′),124.1 (C-6′),128.4 (C-α),129.6 (C-β),105.0(C-1″),75.5 (C-2″),78.1 (C-3″),72.0 (C-4″),79.0 (C-5″),63.1 (C-6″)。

2.2.3 數據歸屬 通過DEPT、HSQC、HMBC、1D-TOCSY等核磁共振實驗對反式曲札茋的1H-NMR、13C-NMR 數據進行歸屬,主要HMBC 相關見圖2。順式曲札茋苷的核磁數據與反式曲札茋苷的相似,主要區別在于前者1H-NMR 中δ 6.34、6.39 可見1 對相互偶合的烯氫信號,偶合常數為12.0 Hz,提示雙鍵構型為順式,參照反式曲札茋核磁數據及文獻[14]中類似結構的化合物,對該成分1H-NMR、13C-NMR數據進行了歸屬,經文獻檢索可知它為首次獲得,而且是新化合物。

圖2 反式曲扎茋苷主要HMBC 相關

2.3 順式曲札茋苷含有量測定及其熱穩定性研究 精密稱取“2.1” 項下樣品適量,甲醇制成40 μg/mL 溶液,即得供試品溶液；精密稱取反式曲札茋苷對照品適量,甲醇制成40 μg/mL 溶液,即得對照品溶液。色譜條件為Grace Apollo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～25 min,15%～30%A；25～30 min,30%～40% A；30～35 min,40%～15% A；35～40 min,15% A)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長319 nm；進樣量10 μL。

取“2.1” 項下樣品適量,于溫度25 ℃、相對濕度60%環境中貯存,于0、24 h 在上述色譜條件下進樣測定,測得順式曲札茋苷純度分別為97.1%、84.2%,表明該成分穩定性較差。

取避光保存(批號20140104) 及經強烈日光照射過(批號 20140104-UV-1、20140104-UV-2、20140104-UV-3,分別于約100 000 lx 日光下直射約1 h、15 min、5 min) 的反式曲札茋苷原料藥進行測定,色譜圖見圖3。結果,避光保存的原料藥中順式曲札茋苷質量分數為0.18%,而3 批經強烈日光照射者分別為33.15%、9.16%、4.12%,表明光照會誘導反式曲札茋苷異構化,增加順式曲札茋苷雜質含有量。

圖3 供試品溶液（經強烈日光照射過的） 中2 種成分HPLC 色譜圖

取原料藥(批號20140104-UV-2) 2 份,25%乙醇制成0.5 mg/mL 溶液,分別置于80、100 ℃水浴中加熱1 h,減壓蒸干,測得順式曲札茋苷質量分數分別為3.69%、0.77%。由此表明,加熱會促進順式曲札茋苷轉為反式,而且溫度越高,轉化率越高,同時提高反式曲札茋苷純度。

2.4 順式曲札茋苷抗凝血活性研究 參考文獻 [15]報道。

2.4.1 Tris-NaCl 緩沖液制備 稱取Tris 適量,加入NaCl適量后用水溶解,濃HCl 調節pH 至8.40,即得(含Tris 0.05 mol/L、NaCl 0.3 mol/L),在4 ℃下保存。

2.4.2 熒光底物溶液制備 稱取Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC適量,加水溶解,制成4 mmol/L 溶液,即得,在4 ℃下保存,臨用前用水稀釋到所需濃度。

2.4.3 凝血酶溶液制備 臨用前取10 IU/mL 人凝血酶原液適量,加水稀釋至所需濃度,即得,置于冰上待用。

2.4.4 待測溶液制備 取阿加曲班(陽性對照)、順式曲札茋苷、反式曲札茋苷適量,DMSO 分別制成50 μmol/L、30 mmol/L、3 mmol/L 母液,臨用前用DMSO 稀釋至所需濃度,即得(以DMSO 為空白對照組)。

2.4.5 測定方法 采用熒光法測定。反應體系為樣品溶液及陽性、空白對照溶液各1 μL,酶溶液5 μL (1 IU/mL),緩沖液24 μL,水50 μL,加到96 孔板中,再加入底物溶液20 μL (200 μmol/L),立即置于酶標儀上測定。設置樣品孔(樣品+酶)、標準孔(DMSO+酶)、空白孔(DMSO+水),激發光390/40 nm,發射光460/40 nm,測定時間間隔51 s,頂部檢測,增益70,在25 ℃下反應10 min,每個濃度設置2 個副孔,測定凝血酶抑制率,取平均值,公式為抑制率=[(△V標準孔-△V樣品孔)/ (△V標準孔-△V空白孔) ]×100%,其中△V 為平均反應速度,通過GraphPad Prism 6 軟件對樣品反應濃度對數與抑制率作圖,計算IC50。結果,阿加曲班IC50為29.63 nmol/L,表明造模成功,順式曲札茋苷、反式曲札茋苷IC50分別為48.42、3.40 μmol/L。

3 討論

文獻[16]對順式曲札茋苷的抗氧化活性進行了模擬預測,但該研究是基于理論推斷,并未獲得具體化學實體。本實驗通過光化學反應首次將反式曲札茋苷轉化為順式異構體,經HPLC 分離后在低溫條件下回收溶劑,并通過高分辨質譜、核磁共振、紫外光譜等技術對其結構進行鑒定,可為進一步考察相關分析方法和生物活性奠定基礎。

前期對光化學反應的轉化條件進行了考察,比較了254、365 nm 紫外光源及日光(約100 000 lx),發現365 nm紫外光源及日光的轉化效率遠高于254 nm 紫外光,為確保反應可控性,最終采用365 nm 紫外光源；比較了15 min～10 h 的照射效果,發現15 min 內即有順式曲札茋苷產生,隨著照射時間延長其得率增加,但過長(＞8 h) 時溶劑顏色加深,表明有其他微量成分產生,增加后續色譜分離難度,最終確定轉化時間為4 h；比較了甲醇、甲醇-水、乙醇、乙醇-水、丙酮等多種溶劑,發現甲醇、甲醇-水、乙醇、乙醇-水的提取效率高于丙酮,為方便溶劑回收,最終選擇甲醇。

通過HPLC 法對光化學反應后的混合物進行分離,考慮到未來工藝,流動相采用廉價、低毒的95% 乙醇-水體系；為保證連續進針以縮短分析時間,采用了等度洗脫；在順式曲札茋苷的制備過程中溫度控制非常關鍵,故將洗脫液用氮氣吹掃后在黑暗環境中冷凍干燥,以避免洗脫液中的該成分再次異構化。另外,順式曲札茋苷在室溫下穩定性較差,雖然最初獲得該成分時純度可高于95%,但24 h內會降低至85% 以下,因條件所限,目前無法獲得其準確可靠的熔點、紅外光譜、旋光等數據,故建議在條件允許的情況下其貯存和使用應盡量處于低溫、避光環境。

由于順式曲札茋苷熱穩定性較差,故現階段該成分成藥性不理想,但常作為雜質出現于反式曲札茋苷中。本實驗初步摸索了順式曲札茋苷雜質的檢測方法,該方法在拉薩大黃指紋圖譜[9]的基礎上對洗脫梯度進行了調整,發現各色譜峰峰形、分離度良好,保留時間適中,能滿足分析要求,并首次證實經強烈日光照射后反式曲札茋苷中含有順式異構體,而且可通過加熱工藝使后者質量分數降低至1%以下。由此提示,在注射用曲札茋苷的生產、貯存過程中應注意避光,而且加熱工藝可降低雜質含有量,與成品質量有較大關聯,故應進一步重點考察并確定參數范圍。

凝血酶是機體凝血系統中的重要組成因子,是觸發凝血反應的效應器,抗凝血酶活性與注射用曲札茋苷防治心腦血管疾病,特別是缺血性腦卒中的藥效密切相關。本實驗發現,順式、反式曲札茋苷均具有抗凝血酶活性,但前者較后者大致降低了1 個數量級。有研究表明,二苯乙烯類化合物順反異構體在實驗動物中的藥動學、組織分布等體內過程有較大差異[17],其安全性也有明顯的不同,如何首烏中順式二苯乙烯苷對3D 培育的肝細胞模型的毒性大于反式異構體,具有更大的肝損傷風險[18],表明順反異構化不但會影響注射用曲札茋苷藥效,對其安全性也有潛在的重要影響。

綜上所述,本實驗為注射用曲札茋苷質量標準的進一步提高,特別是雜質成分的控制提供了參考。今后,將圍繞順式曲札茋苷開展進一步研究,以期提高注射用曲札茋苷質量,保障用藥安全。

致謝：感謝中國藥科大學生藥學研究室、上海中醫藥大學中藥研究所李娟博士對本文的審閱與指導。