大孔吸附樹脂結合HSCCC 分離小葉苦丁茶中2 個苯乙醇苷

張 軍,袁 祥,張李成,胡 曄,楊慶雄*

(1.貴州師范大學化學與材料科學學院,貴州 貴陽 550001;2.貴州師范大學喀斯特學院,貴州 貴陽 550001)

小葉苦丁茶為木犀科女貞屬植物粗壯女貞的葉,是貴州、云南、四川等西南地區常用的飲料植物,應用廣泛,含有多種化學成分,并具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤轉移、肝保護、神經保護、心血管保護、免疫調節[1-9]等多種藥理活性。其中,含有量較高的阿克苷,紫莖女貞苷A被認為是小葉苦丁茶主要活性成分[9-11],He 等[12]用95%乙醇提取苦丁茶,再以D101 大孔吸附樹脂、硅膠、Lichroprep RP-18 為填料,用水、氯仿-甲醇-水反復洗脫分離得到兩者,但分離流程較長。

阿克苷作為多種植物的有效成分,制備分離方法較多,如Li 等[13]用硅膠柱、Sephadex LH-20 凝膠柱結合高速逆流色譜(HSCCC),從車前草中分離得到該成分；Lei 等[14]用75%乙醇提取肉蓯蓉,再用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取提取物,最后以HSCCC 從正丁醇部位中分離得到該成分。阿克苷、紫莖女貞苷A 極性相近,常用硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、HPLC 制備色譜等方法進行分離純化,但過程繁瑣,成本較高,尚無快速同時分離兩者的報道。

因此,本實驗采用大孔吸附樹脂結合HSCCC,簡潔、快速地分離小葉苦丁茶中阿克苷、紫莖女貞苷A,以期為后期該藥材的深入研究和開發提供基礎。

1 材料

1.1 試劑與藥物 小葉苦丁茶采自貴州省余慶縣,經貴州師范大學楊慶雄教授鑒定為正品。HP-20 大孔吸附樹脂(日本三菱化學公司)。色譜純乙腈、甲醇(德國默克公司)；分析純甲醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲酸(天津市富宇精細化工有限公司)。

1.2 儀器 TBE-300C 型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術股份有限公司)；LC-30AD 高效液相色譜儀 (配置SPD-M30A 二極管陣列檢測器)、LCMS-2020 液相色譜-質譜聯用儀(日本島津公司)；N-1300 型旋轉蒸發儀(日本Eyela 公司)；T-214 型電子天平[賽多利斯科學儀器(北京) 有限公司]。

2 方法

2.1 藥材提取和大孔吸附樹脂快速分段 取藥材干燥葉3 kg,粉碎、冷水浸泡3 次(共20 L),每次12 h,將3 次浸取液合并過濾,濾液減壓濃縮至5 L,取100 mL,減壓濃縮除去溶劑待用,剩余濾液按料液比1∶1 上HP-20 非極性大孔吸附樹脂,依次用水、50% 甲醇、甲醇梯度洗脫,每個梯度4 個柱體積,收集50%甲醇、甲醇洗脫部位,減壓濃縮除去溶劑,得到相應部位(褐色粉末)。

2.2 HPLC 條件 Phenomenex ODS 色譜柱 (250 mm×4.6 mm)；流動相水(含0.1%甲酸) (A) -乙腈(B),梯度洗脫(0～14 min,16%～18% B；14～27 min,18% B；27～40 min,18%～40%B；40～50 min,40%～100%B；50～55 min,100%B)；體積流量0.7 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長320 nm。

2.3 HPLC-MS 條件

2.3.1 HPLC Phenomenex ODS 色譜柱 (150 mm ×4.6 mm)；流動相水(含0.1%甲酸) (A) -乙腈(B),梯度洗脫(0～14 min,16%～18% B；14～30 min,18% B；30～35 min,100%B)；體積流量0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長320 nm。

2.3.2 MS 測定時間0～35 min；正負離子分析模式,掃描范圍m/z 200～800；掃描速度1 250 u/s；霧化氣體積流量1.5 L/min；加熱塊溫度 400 ℃；干燥氣 體積流量15 L/min。

2.4 HSCCC 溶劑系統篩選 根據目標化合物性質結合文獻[15-20]確定溶劑系統。將對應比例的溶劑加入到分液漏斗中,上下充分振搖,靜置后分液,稱取分離樣品約1 mg,精密量取上相、下相溶液各1 mL 將其溶解,充分振蕩溶解,待兩相平衡后再分別精密量取0.2 mL,揮干,1 mL甲醇溶解,進行HPLC 分析,計算不同溶劑系統中目標化合物的分配系數K,公式為K=目標化合物在上相溶液中的峰面積/目標化合物在下相溶液中的峰面積。

2.5 HSCCC 分離過程與方法 將上相、下相溶劑系統分液,超聲處理15 min,各取5 mL,再取待分離樣品約200 mg溶于其中,充分搖勻,靜置分層(準備5 份樣品連續進樣)。以上相為固定相,下相為流動相,將泵體積流量設為40 mL/min,泵入上相溶劑至充滿儀器后停泵,啟動主機,將轉速設為850 r/min,體積流量調為10 mL/min,泵入下相溶劑,待上相、下相溶劑同時流出且平衡后,計算保留率,公式為保留率=[(400-平衡后流出的上相體積)/370]×100%,從樣品注射口加入用上相、下相溶解的樣品,設定色譜檢測波長313 nm,溫度25 ℃,當上一針樣品幾乎完全流出時不停機,連續再次進樣,按出峰收集分段。

3 結果

3.1 大孔吸附樹脂分段 3 kg 藥材干燥葉經水提取、大孔吸附樹脂分段、蒸干收集洗脫大孔吸附樹脂后,得到50%甲醇洗脫部位187 g、甲醇洗脫部位66 g,可知藥材能被樹脂吸附的組分主要集中在50%甲醇洗脫部位中,但小極性的甲醇洗脫部位也有約1/3 的量。取“2.1” 項下中未經樹脂處理的水提物及50%甲醇、甲醇部分洗脫部位各4 mg,溶于1 mL 甲醇中,在“2.2” 項條件下進樣2 μL,歸一化法計算峰面積,結果見圖1。由此可知,水提物中紫莖女貞苷A 占總量的24%,阿克苷占9%,經樹脂處理后兩者分別占42%、20%,并主要富集在50%甲醇洗脫部位,再用甲醇洗脫后基本檢測不到兩者。

3.2 HSCCC 溶劑系統篩選 根據文獻[15-20]報道,本實驗考察了氯仿-甲醇-水、乙酸乙酯-正丁醇-水,發現前者按4∶3∶2、5∶3∶2、4∶1∶5 比例洗脫時,阿克苷K 值分別為65、132、1.45,而紫莖女貞苷A 分別為113、212、0.33；后者按4∶0.6∶5、5∶2∶5、4∶3∶4 比例洗脫時,2 種成分K 值分別為1.07、3.6、5.71,0.18、0.98、1.7。由此可知,以乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5) 洗脫時,阿克苷、紫莖女貞苷A 的分離度(兩者K 值的比值) 為3.67,可較好地從混合體系中分離出來,故選擇其作為溶劑系統。

圖1 2 種成分HPLC 色譜圖

3.3 HSCCC 分離 用乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5) 分離“2.1” 項下50%甲醇洗脫部分,按“2.5” 項下方法進樣200 mg,結果見圖2,可知各色譜峰分離度較好,固定相保留率為54%。取分離得到的Ⅰ號峰、Ⅱ號峰物質,在“2.2” 項條件下進樣測定,并與圖1B 進行對比,確定兩者均為目標分離物。再將50%甲醇洗脫部位連續進樣5 次,每次200 mg,結果見圖3,可知HSCCC 中目標峰分離度仍良好。1 g 樣品經500 min 分析后,得Ⅰ號峰265 mg,得率26.5%；Ⅱ號峰300 mg,得率30.0%,面積歸一法測得兩者純度分別為96.5%、98%。

圖2 50%甲醇洗脫部位單次進樣HSCCC 分離情況

圖3 50%甲醇洗脫部位連續進樣HSCCC 分離情況

3.4 化合物鑒定 通過HPLC-MS 將Ⅰ號、Ⅱ號峰化合物與相應對照品進行比對,發現前者與紫莖女貞苷A 保留時間、紫外圖譜、相對分子質量一致,后者與阿克苷保留時間、紫外圖譜、相對分子質量一致。由此可知,2 個化合物分別為紫莖女貞苷A、阿克苷。

4 討論

小葉苦丁茶水提取物經大孔樹脂吸附后,不僅可除去糖類等大極性水溶性組分,而且能通過調節洗脫劑中甲醇體積分數,在50%時將目標分子完全洗脫下來,同時也除去了極性較小、在樹脂柱上吸附較強的其他組分,達到了較好的預分離富集作用,并且該方法簡便快速,成本低廉。在HSCCC 分離過程中采取單次進樣,若進樣量過大,則各物質的出峰分離度會降低,產物純度也不足,但可在不重新灌注新固定相的情況下反復多次進樣,采用相同色譜條件時分離效果可有效保持。本實驗取200 mg 進樣5 次,發現色譜峰基本保持相同的分離效果,可用于快速大量制備分離紫莖女貞苷A、阿克苷,無需停機、清洗、平衡,分離效率明顯,而且5 次進樣分離后由于固定相保留良好,還能繼續使用,可見HSCCC 法可作為大量制備的基礎,增加其規格時能較方便地放大規模。

5 結論

本實驗在快速大量分離小葉苦丁茶中阿克苷、紫莖女貞苷A 時,首先以大孔吸附樹脂對其水提物進行梯度洗脫分段,發現上述2 種成分能大量富集于50%甲醇部位,再選擇乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5) 作為HSCCC 的分離體系,并且在分離過程中采用不停機、多次少量連續進樣的方法,可減小儀器負載,提高出峰成分分離度。結果顯示,該方法穩定方便,能得到純度較高阿克苷、紫莖女貞苷A,并且分離時間短,能很好地提高制備效率。由于連續進樣5 次能得到穩定的分離效果,故今后研究可在此基礎上再進行多次進樣,從而進行更大量的分離。