新型小動物口鼻暴露系統對葉菌唑原藥急性吸入毒性試驗

吳宗澄，張述陽，張智博，張曉軍，金 迪，王華琳

(沈陽沈化院測試技術有限公司安全評價中心/國家沈陽新藥安全評價研究中心，沈陽 110141)

1 引言

葉菌唑原藥是一種新型三唑類廣譜內吸性殺菌劑，主要用于防治小麥赤霉病、小麥白粉病以及小麥銹病等禾谷類作物病害[1]。對殼針孢屬和銹病活性優異，兼具優良的保護及治療作用，既可莖葉處理又可作種子處理[1, 2]。葉菌唑是生產上控制小麥病害的重要殺菌劑品種[1, 3]。該殺菌劑殺菌活性高、抗菌譜廣、內吸性強, 在農藥領域中舉足輕重[1, 4]。目前，國內外有關于葉菌唑毒性測定LD50值(mg/kg)的報道，其中雄性大鼠急性經口劑量為2000 mg/kg、雌性大鼠>2000 mg/kg，雄性大鼠的急性經皮試驗濃度>2000 mg/kg、雌性>2000 mg/kg，葉菌唑對家兔皮膚無刺激性，對家兔眼睛為輕度刺激性[1, 5, 6]。關于葉菌唑氣相色譜-質譜法( GC-MS)、氣相色譜-串聯質譜法( GC-MS /MS) 以及高效液相色譜-串聯質譜法( HPLC-MS /MS) 檢測方法均有報道等[6, 7]。但有關葉菌唑原藥大鼠吸入毒性的報道很少，既原有的試驗數據是使用舊型暴露系統測試得到的吸入毒性試驗數據，但舊型暴露設備及吸入毒性試驗方法陳舊，科學性誤差較大，暴露效果缺乏，數據可靠性低。本實驗參照OECD化學品測試為準則[8]，利用新型口鼻暴露系統對SD大鼠的急性吸入毒性試驗來測定葉菌唑原藥的急性吸入毒性，了解其經呼吸道進入動物機體后對呼吸道以及全身的損傷和危害程度，為該農藥的毒理學安全評價提供較為可靠性的科學資料，為其亞急性吸入毒性試驗及亞慢性吸入毒性試驗奠定了基礎。

2 材料與方法

2.1 受試物與儀器

葉菌唑原藥為白色固體粉末，純度為95%，由某農藥公司提供。稱取60.0 g受試樣品，先用研砵進行研磨，把樣品中的顆粒物研碎，再用九陽磨粉機進行粉碎，最后用行星式球磨儀研磨，處理完畢之后在用銅網進行篩選，篩選完畢的樣品存于樣品室待用。所用主要儀器為：新型小動物口鼻單濃度動態暴露系統選購于北京慧榮和科技有限公司，304不銹鋼300目篩網購自安徽億匯篩網有限公司，行星式高能球磨儀選購于德國萊馳公司，安德森串級撞擊器粒徑分析系統購于北京賽克瑪環保儀器有限公司。

2.2 動物來源與飼養環境

SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供(許可證號：SCXK(京)2016-0002)。引入動物后適應時間為5d，每籠2只動物，并在引入當天進行適應期觀察，健康檢查與體重稱量。實驗動物所食飼料為滅菌全價型營養粉料，可自由飲水，動物房溫度為20～25 ℃，濕度為40%～70%，光周期自動控制，每天明暗各12 h。同時進行適應性保護和固定，以確保在正式試驗時實驗動物能夠適應固定器所帶來的物理壓力，溫度壓力及行動障礙。

2.3 試驗方法

2.3.1 劑量設計

參照OECD化學品測試導則，設計5000 mg/m3、2000 mg/m、31000 mg/m3、0 mg/m3，根據體重采用隨機分組法分為4組，對照組和高劑量組每組20只，雌雄各半，低劑量和中劑量組每組10只，雌雄各半。分組時組內動物體重不能超過平均動物體重的±20%，若5000 mg/m3劑量的實驗動物組均未出現死亡，則急性吸入毒性試驗LC50的判定結果大于5000 mg/m3。

2.3.2 暴露途徑及方法

采用動式吸入暴露方法，使用新型小動物口鼻單濃度動態暴露系統對動物進行吸入暴露。多節口鼻暴露單元沿著內筒的軸線順次連接組成口鼻暴露組，在口鼻暴露塔的頂端連接粉末氣溶膠發生器，底端連接廢氣回收處理裝置。試驗設計的4個劑量同時運行4臺小動物單濃度口鼻暴露系統進行測試試驗，空白組試驗參數方案與高劑量組一致。試驗開始前，將動物分別放入固定器中，動物給藥前先對口鼻暴露組內濃度進行調試，通過調整發生器進給速度，進氣流量及稀釋流量來調試暴露腔內氣溶膠濃度，如果連續2次檢測濃度波動范圍小于±20%，則可以進行正式試驗，將裝有實驗動物的固定器安裝在口鼻暴露塔上，暴露時間為4h，暴露期間實驗動物禁食禁水。染毒結束動物放回籠內并觀察，自由飲水和攝食。

2.3.3 供試品暴露參數檢測

染毒過程中對樣品實際濃度和粒徑分布進行測定、監測及統計分析，并對氣溶膠流量、進樣速度、稀釋流量，抽氣流量，暴露腔內溫度、壓力、相對濕度、氧氣濃度和二氧化碳濃度進行實時監測。暴露系統對環境參數采用每秒自動監測，監測數據自動記錄于設備中，試驗結束自動生成試驗報表，數據顯示整個暴露期間參數均值。

濃度測量：采樣前稱量濾膜重量為M1，采樣結束后稱量濾膜和樣品重量為M2，計算采樣重量(M)，M=M2-M1，暴露腔內氣溶膠濃度為C(mg/m3)=采樣質量(M)/采樣體積(V)×1000(L/m3)。

粒徑測定：使用安德森串級撞擊器粒徑分析系統對暴露腔內粒子空氣動力學直徑進行測定。主要測定2個指標： ①粒子空氣動力學直徑質量中值(MMAD)，②粒子空氣動力學幾何標準差(GSD)。

2.3.4 實驗動物觀察與體重稱量

暴露結束時應對所有實驗動物進行觀察，在試驗結束約1 h后對所有實驗動物再進行一次癥狀觀察，從試驗開始到結束，應每天進行癥狀觀察并記錄各實驗動物中毒癥狀及其發生和緩解、消失的時間。應詳細記錄被毛、呼吸系統、生殖系統、泌尿系統、神經消化系統，眼睛和粘膜所產生的癥狀變化，特別注意觀察供試品對呼吸系統的影響，如供試品對實驗動物的呼吸道產生刺激反應，呼吸頻率的變化以及呼吸和呼吸模式的改變。

體重稱量：實驗動物引入24 h之內，暴露前1 d，暴露日暴露前(第0)，暴露后第1 d、第3 d、第7 d和第14 d進行體重測定。

2.3.5 大體解剖檢查

試驗結束后對全部存活動物 CO2麻醉，并對實驗動物進行放血與解剖檢查。動物進行大體解剖時應全面仔細觀察肺部及上呼吸道的刺激以及局部毒性刺激產生的癥狀，同時檢查胸腔、腹腔、顱腔、各個天然孔道及其內容物，并詳細記錄每只動物的解剖后的癥狀變化。

2.3.6 組織病理學檢查

試驗期間死亡的動物以及試驗結束后的剩余動物都應進行解剖和組織病理學檢查。

2.3.7 數據處理和結果評價

分別統計不同劑量組的動物數目、出現的癥狀、存活數與死亡數，及時觀察大體解剖與病理學組織學檢查時各個器官所發生病變的頻率并計算各劑量組中雌雄動物產生該上述項目的發生頻率，統計不同時間內實驗動物的體重均值與標準差。

根據供試品濃度和動物死亡率，使用SPSS19.0軟件計算急性吸入的LC50的值。根據LC50的結果與表1和表2進行毒性分級。

表1 GHS急性吸入毒性分類標準

表2 毒性分級

3 結果分析

3.1 暴露期間環境參數均值

在暴露過程中對暴露腔內氣溶膠流量、稀釋流量，暴露腔內溫度、相對濕度、氧氣濃度和二氧化碳濃度等導則要求的環境參數進行實時監測，暴露系統對環境參數采用每秒自動監測，監測數據自動記錄于設備中，試驗結束自動生成試驗報表，數據顯示整個暴露期間參數均值，結果見表3.

3.2 實際濃度和粒徑分布

暴露期間暴露腔內的氣溶膠實際濃度被測量，從高到低實際濃度分別為5038±33、2065±50、1005±25 mg/m3。實測濃度結果見表4。

使用粒子空氣動力學粒徑譜分布儀管理軟件進行采集和測定，主要測定兩個指標:①粒子空氣動力學直徑質量中值(MMAD)，②粒子空氣動力學幾何標準(GSD)，結果見表5。

表3 環境參數結果

表4 實際濃度結果

表5 粒徑分布

3.3 死亡結果及觀察

5000 mg/m3劑量組雌雄動物吸入暴露結束后第1 d，雌雄各2只動物出現自發運動低下癥狀，暴露第2 d，雌性2只動物死亡，3只穿自發運用低下，呼吸聲音異常，步行困難等癥狀，雄性3只死亡，2只出現自發運動低下，口鼻周有分泌物癥狀；第3 d雌雄動物全部死亡。

2000 mg/m3劑量組吸入暴露第1 d后，雌性1只動物出現自發運動低下，雄性1只動物死亡；吸入暴露2 d后，3只出現被毛蓬松，會陰污穢，1只出現被毛蓬松，口鼻周有分泌物；2只自發運動低下；吸入暴露第3 d后，雌性2只死亡，雄性癥狀逐漸恢復；吸入暴露第4 d后，所有動物癥狀減輕；吸入暴露第5 d后，所有實驗動物均正常。

1000 mg/m3劑量組和空白對照組給藥后沒有死亡，連續觀察14 d至試驗結束沒有異常改變。

3.4 體重稱量結果

高、中和低濃度組動物體重在暴露后第1 d雌雄都呈現體重降低趨勢，在第3 d都基本恢復正常，一直到試驗結束都呈現增長趨勢，結果見表6。

表6 體重稱量結果

3.5 解剖與組織學觀察結果

高和中劑量組動物的死亡解剖均發現肝臟暗紅色癥狀，有肺部紅斑癥狀；其他計劃解剖未見異常；組織學所見：葉菌唑原藥對高劑量組和中劑量組死亡動物的肝臟有輕度的致肝細胞肥大的作用和對肺臟有致泡沫細胞團的作用。

4 結論與討論

根據葉菌唑暴露濃度和動物死亡率，使用SPSS19.0軟件用概率單位法方法計算急性吸入的LC50的值，雄鼠為2221 mg/m3，雌鼠為2064 mg/m3。根據之前報道過的葉菌唑大鼠急性經口毒性LD50為雄性1470 mg/kg，雌性1080 mg/kg ，大鼠急性經皮毒性LD50為>2000 mg/kg，同時根據GHS標準(表1)對烯肟菌酯進行急性毒性分級，烯肟菌酯原藥急性吸入毒性為4級，屬于低毒。同時結果表明：葉菌唑對靶器官為肝臟和肺臟。

小麥作為重要的糧食作物，在中國人餐桌上的呈現形式多種多樣。因此，優質小麥種植的意義深遠，小麥的安全生產備受關注。實現優質小麥的無公害生產，提高國際市場的競爭力，增加農民收入，是我國現代農業發展的必然趨勢。葉菌唑原藥是一種活性高、抗菌譜廣、內吸性強的殺菌劑，主要用于防治小麥赤霉病、小麥白粉病以及小麥銹病等禾谷類作物病害[1]。對殼針孢屬和銹病活性優異，兼具優良的保護及治療作用，既可莖葉處理又可作種子處理。葉菌唑是生產上控制小麥病害的重要殺菌劑品種。但有關葉菌唑原藥吸入毒性的報道尚未見到。本試驗使用新型小動物口鼻暴露系統來檢測葉菌唑原藥對SD大鼠的急性吸入性，了解了其吸入動物呼吸道后對呼吸道與全身的損傷以及危害。對未來葉菌唑的安全使用可提供有效的試驗依據。