NexGard 中阿福拉納提取與純化工藝研究

趙晶晶

（山西省畜牧產品質量安全檢驗監測中心太原 030027）

隨著我國社會經濟的快速發展，人們對生活品質的要求日益提高，越來越多家庭加入科學養寵隊伍，據粗略統計目前中國在冊的寵物犬數量已超7,500 萬，其中，城鎮地區養犬量超5,500 萬只[1,2]。然而，寵物犬好動，喜歡到處玩耍、聞舔，極易感染寄生蟲病、皮膚病、傳染性疾病等，其中以寄生蟲病最為多發。常見的體外寄生蟲有蜱蟲、跳蚤等，體內寄生蟲有心絲蟲、蛔蟲、鉤蟲、鞭蟲等，不僅影響寵物的身心健康，還因繁殖力強而污染環境，進而給人的健康帶來隱患；此外，也極大地減弱寵物主與寵物的親密接觸意愿，因此，防治寵物犬寄生蟲病尤為重要[3,4]。

臨床上，寵物犬體內寄生蟲病的防治主要依賴大環內酯類抗寄生蟲藥物，應用最為廣泛的有伊維菌素、塞拉菌素、莫昔克丁、米爾貝肟等。近年來，藥物化學家們依次發現幾種新型異噁唑啉類小分子化合物對犬跳蚤和蜱蟲等體外寄生蟲有突出的藥理活性，如阿福拉納（a foxolaner）[5]、氟雷拉納（fluralaner）[6]、沙羅拉納（sarolaner）[7]和洛替拉納（lotilaner）[8]（結構如圖1所示），該類藥物擬通過抑制GABA氯離子通道，使節肢動物神經高度興奮導致死亡，是強效殺蟲劑。2017年8月，勃林格殷格翰宣布其針對跳蚤和蜱蟲兩類寄生蟲的犬用口服驅蟲藥“尼可信”（NexGard，商品名為阿福拉納咀嚼片[9]）在中國上市，次年8月又宣布首個犬用口服體內外寄生蟲同驅產品“超可信”（NexGardSpectra，商品名為阿福拉納米爾貝肟咀嚼片）在中國上市。這兩款寵物藥很快在中國寵物市場占領了一席之地，消費者反饋良好。我國很多新藥研發機構也紛紛加入這兩款藥物的自主研發，期望以“阿福拉納”為敲門磚，啟發開拓異噁唑啉類活性物質研發思路。

我國關于阿福拉納的各項研究均處于萌芽階段，化合物的合成及純化、成品的質量研究及藥理毒理研究均未取得較理想的成果。造成這一難題無法向前推進的一個基本原因，就是無法取得對照品或高純度樣品，使得現有研究成果可靠性、科學性和嚴謹性都十分不足，包括結構確證、分析方法等研究方面均無法準確定位。陳春青等人[10]早前發明了同類產品“氟雷拉納（fluralaner）咀嚼片”中提取并純化主成分的方法，滿足了前期對較純化合物的量的需求，并為后期檢驗工作提供了參考。目前，阿福拉納對照品暫無銷售渠道，本試驗或能參考此專利方法，試從上市制劑“尼可信”中提取出阿福拉納化合物，經過進一步的分離純化從而得到高純度產品，純度檢測采用薄層色譜和高效液相色譜法相結合，該研究內容國內外均未見報道。Zhuang 等人[11]運用手性HPLC 法對阿福拉納作了大量分析，這為本方法中HPLC 法的建立提供了基礎依據。本方法能夠快速解決短期內因合成工藝復雜而無法取得一定需求量的化合物（純度符合要求，不低于99%），也能為后期關于該藥物藥動、藥代學研究樣品前處理方法中的幾項參數確定提供研究思路，如組織中藥物提取溶劑、方法、萃取溶劑等。

圖1 四種獸醫臨床常用的異噁唑啉類驅蟲藥

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 材料與試劑阿福拉納咀嚼片（梅里亞有限公司法國吐魯茲生產廠，規格：136mg）；100～200 目層析硅膠、磷酸、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚（國藥試劑，AR）；乙腈（HPLC）。

1.1.2 主要儀器萬能粉碎機、磁力攪拌器、反應瓶、油浴鍋、冷凝管、水泵、布氏漏斗、旋轉蒸發儀、層析柱、微量進樣器、硅膠板G254、紫外分析儀、紫外-可見分光光度計、超純水儀、高效液相色譜-串聯質譜儀、紅外光譜儀、核磁共振波譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 粉碎取60 粒阿福拉納咀嚼片，約300g，置于萬能粉碎機中，粉碎成小顆粒狀，備用。

1.2.2 提取取粉碎后樣品約10g （相當于2 粒阿福拉納咀嚼片，含C26H17ClF9N3O3約272mg），加入提取溶劑（從4 種常用溶劑中篩選），開啟攪拌，加熱至回流，抽濾。濾渣同法進行二次提取，合并濾液，照薄層色譜法進行TLC 點板，在紫外分析儀254nm 處檢測，判定主斑點深淺及雜質斑點個數及深淺，粗略判定純度；然后置于旋轉蒸發儀進行減壓濃縮至干，得粗品（TLC 純度不低于85%）。

1.2.2.1 溶劑的選擇分別選擇4 種常用溶劑（包括二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、石油醚）按1.2.2 項下提取方法進行提取試驗，篩選出最優提取溶劑。

1.2.2.2 溶劑量的確定分別加入樣品的10 倍、20 倍、30 倍體積質量比的1.2.2.1 項篩選出的最優提取溶劑，照1.2.2 項下提取方法進行提取試驗，確定最優提取溶劑量。

1.2.2.3 回流時間的確定在樣品中加入1.2.2.1 項和1.2.2.2項擇出的最優溶劑種類及溶劑量，照1.2.2 項提取方法進行試驗，分別回流1h、2h、3h，篩選出最合適的回流時間。

1.2.3 分離純化取定量粗品進行柱層析分離，濕法上樣，以二氯甲烷/ 甲醇（40:1，v/v）為洗脫液進行洗脫，收集洗脫液并即時進行紫外分析，待分析結果顯示有目標單體時（粗品點板主斑點Rf值作為參考對照），開始收集洗脫液并做標記，至分析結果無目標物時，結束收集，合并所有標記的洗脫液，濃縮至干，得產品（TLC純度不低于95%）。

1.2.4 最大吸收波長測定取樣品適量，加流動相溶解并稀釋制成5μg/mL 的溶液，在200～600nm 測定吸光度，供試品在312nm 附近有最大吸收。

1.2.5 純度測定建立HPLC 檢測方法并進行方法學驗證，按面積歸一化法計算純度。

1）色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，推薦AgilentZorbaxSB-C18（150mm×4.6mm，5 μm）；以0.05%磷酸溶液（pH 2.4）為流動相A，乙腈為流動相B，按下表進行線性梯度洗脫；檢測波長為312nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；進樣體積為20μL。

表1 流動相梯度

2）分析方法：取純化后樣品適量，精密稱定，加流動相超聲溶解并定容制成5μg/mL的溶液，搖勻。精密量取20μL注入液相色譜儀，按面積歸一化法以峰面積計算。

3）標準曲線繪制：分別配制2、4、5、10 和20μg/mL的對照樣品供試液，依次進樣，得到色譜圖，按面積歸一化法，用峰面積對進樣濃度進行線性回歸分析。

4）精密度：取對照樣品溶液（5μg/mL）連續進樣5 次，記錄色譜圖，計算RSD。

5）溶液穩定性：將對照樣品溶液（5μg/mL）分別于0、2、4、6、8、12 和24h 取樣分析，記錄色譜圖，計算RSD。

6）重現性：稱取對照樣品6 等份，配制為5μg/mL，進樣，記錄色譜圖，計算RSD。

7）準確度：稱取3 份對照樣品，分別配制為4、5 和6μg/mL，進樣分析，記錄色譜圖，計算回收率及RSD。

1.2.6 結構確證依次通過紅外光譜（IR）、質譜（MS）、核磁共振氫譜（1HNMR）進行結構確證。

2 結果與分析

2.1 提取方法的確定

2.1.1 不同提取溶劑對提取效率的影響由表2 可知，二氯甲烷的提取效率最好，因此二氯甲烷為本試驗最優提取溶劑。

表2 不同溶劑對提取結果的影響

2.1.2 不同溶劑量對提取效率的影響采用二氯甲烷按1.2.2 項提取方法進行試驗，分別吸取部分提取液稀釋至同一比例后再進行TLC 點板，結果顯示20 倍、30 倍體積比的二氯甲烷提取效率較好（表3），考慮到經濟環保，最終選擇20 倍體積比二氯甲烷為最優提取溶劑量。

表3 不同溶劑量對提取結果的影響

2.1.3 不同回流時間對提取效率的影響采用20 倍體積比的二氯甲烷按1.2.2 項提取方法進行試驗，結果顯示回流2h、3h 后的提取效率較好（表4），考慮到操作效率，最終選擇回流2h 為最優回流時間。

表4 不同回流時間對提取結果的影響

2.2 分離純化結果

由表5 可知，采用20 倍體積比的二氯甲烷提取，回流2h 后進行柱層析分離純化的效率可觀，3 批次提取純化的阿福拉納提取率均達到80%，TLC 點板顯示無雜質斑點，主斑點深，說明提取物純度極高。

表5 提取純化結果

2.3 樣品中阿福拉納純度測定

本試驗經多次條件摸索，最終建立了高效液相色譜法測定阿福拉納純度，該方法經系統方法學驗證，準確度良好，4、5 和6μg/mL濃度的回收率分別為99.55%、99.34%和99.86%；精密度高，連續進樣，主峰峰面積RSD 低于2.0%，重現性好；在2～20μg/mL呈現良好的線性相關（r>0.999）。

3 批次提取純化樣品的純度測定結果分別為99.52%、99.26%和99.31%（圖2），達到藥物研發工作對標準物質的純度需求。

圖2 阿福拉納（3 批次）液相圖譜

2.4 樣品中阿福拉納的結構確證

本試驗提取純化的阿福拉納經紅外光譜、質譜及核磁共振光譜法分別分析鑒定，圖譜見圖4～6，其特征結構由以下特征數據確證：

1）紅外光譜[IR(KBr)，ν(c m-1)]：3305，1694，1653，1529，1331，1306，1277，1240，1169，1137c m-1。

圖3 阿福拉納結構

2）質譜[ESI-MS(m/z)]：648.2[M+Na]+。

3）核磁共振氫譜[1HNMR（300MHz，DCl3），δ（p p m）]：1H NMR（300MHz，DMSO-D6），δ（p p m）：8.95 （t，1H），8.84（d，1H），8.74 （t，1H），8.40 （d，1H），8.10 （d，2H），7.93（d，2H），7.75-7.04（m，3H），4.64（s，2H），4.08-4.00（m，4H）。

3 討論

本試驗確定的提取方法操作簡便，所用試劑易得且可回收，提取率達到80%；提取產物經純化后，產品純度達到99%，顯示提取與純化方法符合高效便捷的實際應用要求。本試驗中建立的純度檢測方法可靠，準確度和精密度均符合獸藥檢測標準。此外，本試驗還對國內不同廠家提供的阿福拉納原料進行了較系統全面的質量研究，各家產品僅在純度控制上有差異，這與合成工藝的不同息息相關，后期對雜質的控制與研究應進一步加深。

阿福拉納目前在國外已被廣泛應用，我國引入后應用反饋也十分滿意，但國內關于阿福拉納的各項研究均處于起步階段，相關報道也甚少。根本原因為阿福拉納進口對照品價格昂貴，難于獲得且合成難度大，因此，本試驗提供的快速獲得高純度的原料方法將為我國自主研發阿福拉納及其相關類型的新藥提供新思路與動力。本試驗建立的提取方法也可為阿福拉納制劑研究及藥代動力學研究過程中樣品前處理方法的建立打下基礎，建立的高效液相色譜法為之后該藥物系統的質量研究工作具有重要指導意義。

圖4 阿福拉納紅外光譜圖

圖5 阿福拉納質譜圖

圖6 阿福拉納核磁氫譜圖