雙葛止瀉口服液對小鼠的抗炎止瀉藥效學研究

桑卡娜，李召斌，晏磊，楊絨娟，高艷艷，周德剛

（國家獸用藥品工程技術研究中心/ 洛陽惠中獸藥有限公司河南洛陽 471003）

雙葛止瀉口服液是由洛陽惠中獸藥有限公司、普萊柯生物工程股份有限公司和河南新正好生物工程有限公司聯合研制的三類新獸藥。雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根、黃芩、黃連、白芍和炙甘草組成，來源于《傷寒論》中的“葛根芩連湯”。雙葛止瀉口服液方中金銀花清熱解毒，涼血止瀉，葛根止瀉生津，鼓舞胃氣，二者共為君藥，具有解熱、抗炎、抗病毒等藥理作用[1,2]；以苦寒之黃連、黃芩為臣，清熱燥濕，厚腸止瀉；白芍養血合營，緩急止痛為佐藥；炙甘草調和藥性，合白芍酸甘化陰，緩急止痛。全方配伍，共奏清熱解毒，止瀉生津之功。文獻報道葛根芩連湯對感染性腹瀉具有一定的治療作用[3,4]。為了研究雙葛止瀉口服液的藥理作用，考察其對小鼠抗炎止瀉效果，本研究采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型，來研究抗炎作用，采用番瀉葉腹瀉模型和墨汁推進法來探討雙葛止瀉口服液止瀉作用，為其臨床應用提供理論依據。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

4 周齡健康BALB/c 小鼠50 只，雄性，SPF 級，許可證號：SCXK（京）2016—0011，4 周齡健康BALB/c 小鼠130 只，雌雄各半，SPF級，許可證號：SCXK（京）2016—0011，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。于普萊柯生物工程股份有限公司經河南省試驗動物協會認證通過的SPF 小鼠應用合格的動物房內觀察3d 無異常進行試驗，使用小鼠IVC 獨立送風隔離籠具。飼養條件：滅菌全價飼料喂養，自由采食與飲水，室溫20～24℃，相對濕度40%～60%。

1.2 試驗藥品

雙葛止瀉口服液，規格：每1mL相當于原生藥0.45g，批號：20170201，洛陽惠中獸藥有限公司；

楊樹花口服液，規格：每1mL 相當于原生藥1g，批號：16092002，鄭州后羿制藥有限公司。

1.3 試驗儀器及試劑

YLS-Q4 型耳腫打耳器，上海艾研生物科技有限公司；AB265-S型電子分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；Milli-Q 型（超）純水機，美國Millip ore 公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE-2000B旋轉蒸發儀、SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵，鞏義予華儀器有限公司；JA2003 電子天平，上海上平儀器有限公司。

二甲苯，批號：20080419，派尼化學試劑廠；番瀉葉，批號：150701，購自河南百信藥房；6 號灌胃針；一次性使用無菌注射器；濾紙；鋼尺；碳素墨汁；計時器；解剖剪等。

2 試驗方法

2.1 雙葛止瀉口服液對小鼠耳腫脹抗炎作用研究

2.1.1 分組和給藥方法取健康小鼠50 只，隨機分為5 組，每組10 只，分別為雙葛止瀉口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）劑量組，楊樹花口服液對照組（3.15mL/kg·d-1）和模型對照組。4 個給藥組均按0.1mL/10g灌胃給藥，2 次/d，給藥間隔6h，連續給藥3d，模型對照組灌服蒸餾水。末次給藥30min 后，于小鼠右耳正反兩面分別用10μL移液器滴10μL二甲苯，左耳不涂作為對照，1h 后頸椎脫臼處死小鼠，用直徑8mm 打孔器打下左右耳，稱重，左耳做對照，以左右耳片重量差作為腫脹度，計算腫脹抑制率。

2.1.2 評價標準以模型對照組小鼠左右耳作為對照，構建小鼠耳腫脹模型，當模型對照組左右耳重差異顯著或極顯著時（P<0.05或P<0.01），表明模型構建成功。腫脹度=致炎耳片重（右耳）－非致炎耳片重（左耳）。腫脹抑制率（%）=（模型組腫脹度－給藥組腫脹度）/ 模型組腫脹度×100。

給藥組與模型對照組比較，腫脹度統計學差異顯著或極顯著時（P<0.05 或P<0.01），表明雙葛止瀉口服液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹具有抑制作用。

2.2 雙葛止瀉口服液對番瀉葉所致腹瀉小鼠止瀉作用研究

2.2.1 番瀉葉制備取番瀉葉125g，加10 倍量水煮沸10min，過濾，濾液減壓濃縮成200mL，即濃度為0.625g/mL，4℃冰箱保存，用時水浴加溫至25℃[6-9]。

2.2.2 分組和給藥方法取健康小鼠60 只，隨機分為6 組，每組10 只，雌雄各半。6 個組分別為雙葛止瀉口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）劑量組、楊樹花口服液對照組（3.15mL/kg·d-1）、模型對照組和空白對照組。0.1mL/10g 灌服給藥，2 次/d，給藥間隔6h，連續給藥3d；模型對照組和空白對照組灌服同體積蒸餾水。末次灌胃給藥前禁食12h，自由飲水。末次灌胃給藥0.5h 后，除空白對照組灌服0.5mL蒸餾水外，其他各組小鼠灌服番瀉葉提取液0.5mL/ 只。灌服番瀉葉提取液后每只小鼠單獨放一鼠籠中，籠底部放濾紙，每隔2h 換墊紙，觀察各組小鼠的一般臨床癥狀和腹瀉情況，統計出0～2h、2～4h、4～6h 和0～6h每只小鼠的稀便率和稀便級，并計算各組小鼠的腹瀉指數。

2.2.3 評價標準①稀便率：稀便率=每只動物的稀便次數/ 每只動物大便的總次數（稀便以濾紙上有污跡為標準）；糞便次數以每粒或每堆（不能分清粒數者）為1 次。②稀便級：表示稀便的程度，以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級。分為4 級，標準如下：1 級：污跡直徑<1c m；2 級：污跡直徑1～1.9c m；3 級：污跡直徑2～3c m；4 級：污跡直徑>3c m。先逐個統計每一堆稀便的級數，然后將該鼠所有稀便級數相加除以稀便次數得稀便的平均級數，即為稀便級。污跡直徑的測量方法：糞便形狀為圓形，則直接量直徑；若糞便形狀為橢圓形則測量最長和近似圓的直徑，相加除2。③腹瀉指數：腹瀉指數=稀便率×平均稀便級。

2.3 雙葛止瀉口服液對小鼠腸運動影響試驗

取健康小鼠50 只，隨機分為5 組，每組10 只，分別為雙葛止瀉口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）劑量組，楊樹花口服液對照組（3.15mL/kg·d-1）和模型對照組。按0.1mL/10g 灌胃給藥，2 次/d，給藥間隔6h，連續給藥3d；空白對照組按0.1mL/10g 灌服蒸餾水。末次灌胃給藥前禁食12h，自由飲水，末次灌胃給藥0.5h后，各組小鼠均按照0.2mL/ 只灌胃給予10%碳素墨汁，20min 后用頸椎脫臼法將小鼠處死，將消化管自幽門至直腸末端完整地摘出，用直尺測量小腸全長及幽門至墨汁前沿的距離，記錄試驗中每只小鼠的小腸全長（c m）和墨汁移動距離（c m），并計算墨汁推進率。

墨汁推進率（%）=墨汁移動距離（c m）/ 小腸全長（c m）×100%

2.4 數據處理

所得數據用SPSS 19.0 統計軟件進行處理。結果用均值±標準差表示。統計方法采用單因素方法分析，顯著性用P 值表示，其中P<0.01 表示差異極顯著，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示無顯著性差異。

3 結果

3.1 雙葛止瀉口服液對小鼠耳腫脹抗炎作用研究

各組小鼠右耳進行二甲苯致炎后，右耳均出現不同程度的紅腫。左耳耳重12.80±0.57（mg），右耳耳重21.24±3.11（mg），且右耳重極顯著高于左耳（P<0.01），表明本試驗采用的小鼠二甲苯致炎模型成功，可以用于抗炎作用研究。

雙葛止瀉口服液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹的影響試驗結果如下表1。

表1 雙葛止瀉口服液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹的影響（D,n=10）

表1 雙葛止瀉口服液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹的影響（D,n=10）

注：上標無相同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），上標無相同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

由表1 結果可知，雙葛止瀉口服液組中、高劑量組和楊樹花口服液對照組小鼠耳廓腫脹度明顯低于模型對照組，紅腫程度有所減輕，且腫脹抑制率差異極顯著（P<0.01），表明雙葛止瀉口服液具有抗炎作用，且雙葛止瀉口服液的劑量越大，腫脹度越小，抗炎作用越強。

3.2 雙葛止瀉口服液對番瀉葉所致腹瀉小鼠止瀉作用研究

所有灌服番瀉葉提取液小鼠在灌服0.5h 后均開始出現精神沉郁、背毛逆立；臥地不動、縮頭、腹部劇烈抽動；個別小鼠閉眼、眼內有少量分泌物等臨床癥狀。灌服番瀉葉1h 后，均出現稀便，4～6h 時部分小鼠稀便消失，精神恢復，行為活躍。6h 后所有小鼠均未見稀便，精神、糞便恢復正常。

利用SPSS19.0 統計各組在灌服番瀉葉后腹瀉指數的差異，具體結果見表2。

表2 給藥3d 后灌服番瀉葉腹瀉指數統計分析（D,n=10）

表2 給藥3d 后灌服番瀉葉腹瀉指數統計分析（D,n=10）

注：同一列中，肩標無相同小寫字母者，為差異顯著（P<0.05）；同一列中，肩標無相同大寫字母者，為差異極顯著（P<0.01）。

由表2 統計結果可知，上表4 個時間段內，空白對照組與模型對照組相比腹瀉指數均有極顯著差異（P<0.01）；臨床觀察結果可知所有灌服番瀉葉提取液小鼠均出現不同程度的精神沉郁和拉稀等癥狀，而空白對照組無拉稀，糞便均正常，表明小鼠的番瀉葉腹瀉模型構建成功。0～6h 的統計結果可知，模型對照組與雙葛止瀉口服液低、中、高劑量組和楊樹花對照藥組比差異均極顯著（P<0.01）。

3.3 雙葛止瀉口服液對小鼠腸運動影響試驗

小鼠灌胃給藥后，雙葛止瀉口服液低劑量組小鼠腸道的推進率小于空白對照組，但差異不顯著（P>0.05），表明雙葛止瀉口服液低劑量不能有效的抑制腸推進。雙葛止瀉口服液中、高劑量組、楊樹花口服液對照組腸道的推進率均顯著低（P<0.05）于空白對照組，表明雙葛止瀉口服液中、高劑量組和楊樹花口服液對照組均能有效的抑制腸道蠕動，降低小腸推進率。統計結果見下表3 所示。

表3 雙葛止瀉口服液對小鼠的腸推進影響（D,n=10）

表3 雙葛止瀉口服液對小鼠的腸推進影響（D,n=10）

4 討論

4.1 小鼠耳腫脹抗炎作用研究

二甲苯致小鼠耳腫脹模型是急性非特異性炎癥模型，是評價抗炎藥物常見的方法，一般全部選擇雄性動物，以防雌激素的抗炎和免疫抑制作用[5,6]。腹瀉與腸道黏膜的損傷和各種炎性介質的釋放有關，因而藥物的抗炎效果也是其發揮止瀉作用的重要機制之一。雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根、黃芩、黃連、白芍和炙甘草提取液組成，金銀花對發熱模型大白鼠及炎性模型小鼠均有防止體溫升高和消除炎癥的作用，表明金銀花具有明顯的清熱解毒抗炎功效[7]。文獻報道黃連中的小檗堿類和白芍中的主要成分白芍總苷（TGP）均能抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹，抑制率達73.9%和84.1%[8]，表明對炎癥均有抑制作用。為了考察雙葛止瀉口服液在治療疾病時對機體的抗炎作用，本試驗采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型來評價抗炎作用。由本試驗結果可知，小鼠在給予一定量的雙葛止瀉口服液后可明顯減輕二甲苯所致的耳腫脹，說明雙葛止瀉口服液能阻止炎性滲出并減少紅腫，具有一定的清熱抗炎作用。

4.2 番瀉葉所致腹瀉小鼠止瀉作用研究

番瀉葉主要成分為蒽醌類衍生物，番瀉葉苷A、B、C、D，大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素和葡萄糖甙，是臨床常用的瀉下藥。王勝義[9]等報道黃白口液能明顯減少番瀉葉引起的小鼠腹瀉次數。毛瑩[10]等報道的在以番瀉葉致瀉為模型，以腹瀉指數為測定指標的試驗中，葛根芩連湯能明顯的減少番瀉葉引起的小鼠腹瀉次數，具有良好的止瀉作用（P<0.01）。番瀉葉腹瀉模型使用較普遍；且使用番瀉葉模型具有操作簡單，周期短，模型穩定，重復性好，發病率高等特點，常作為篩選抗腹瀉藥物的模型。

本研究采用腹瀉指數作為指標來評價雙葛止瀉口服液的止瀉作用，在番瀉葉腹瀉模型中應用腹瀉指數這一指標來反映稀便的程度，既可考慮到稀便量的變化，又能考慮到質的因素，比單用稀便率與稀便級這兩個指標更全面更客觀，并使之具有可比性[11]，故本試驗采用的評價指標為腹瀉指數。

采用番瀉葉造模后，各組小鼠均出現腹瀉癥狀，灌服番瀉葉后0～6h 觀察結果可知，各給藥組與模型對照組相比腹瀉指數均極顯著降低（P<0.01），本試驗結果與文獻報道基本一致，表明雙葛止瀉口服液對番瀉葉所致小鼠腹瀉有一定的止瀉作用，能減輕小鼠的腹瀉程度。

4.3 小鼠腸運動影響試驗

雙葛止瀉口服液中的君藥葛根具有解肌退熱、止瀉等功效[12]，其主要成分為葛根素、大豆苷等異黃酮類化合物。鐘凌云等[13]進行了葛根主要藥效成分止瀉作用研究，結果表明葛根中的葛根素、大豆苷能極顯著降低小腸推進率（P<0.01），隨給藥劑量的增加，小腸推進率呈減弱趨勢，在一定劑量范圍內存在良好量效關系。文獻報道表明，葛根素與大豆苷元具有明顯抑制胃排空和小腸推進率作用，臨床上可用于治療泄瀉[14-16]。

本研究通過小腸推進性運動試驗，計算墨汁推進率，觀察不同劑量的雙葛止瀉口服液對胃腸蠕動的作用影響。結果顯示，與空白對照相比，雙葛止瀉口服液中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）劑量均能顯著抑制胃腸蠕動，抑制小腸推進（P<0.05），高劑量組腸推進百分率低于中劑量組。表明雙葛止瀉口服液具有明顯抑制小鼠小腸推進作用，該作用是抑制腹瀉的重要機制之一，且該作用具有一定的劑量相關性。

5 結論

綜合以上研究結果表明，雙葛止瀉口服液具有一定的止瀉抗炎等功能，其止瀉機制與抑制胃腸運動具有相關性。