芝麻素對低氧條件下鼠嗜鉻細胞瘤細胞β淀粉樣蛋白和β位淀粉樣前體蛋白裂解酶-1表達影響的實驗研究

朱俊艷，陳筱山，郭彥祥，王 磊

(1.西安市精神衛生中心精神科,陜西 西安 710061；2.西安市中心醫院神經內科,陜西 西安 710003)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又被稱為老年性癡呆，是近年來較為普遍的一種神經變性疾病，主要臨床癥狀表現為：記憶力逐漸衰退，生活能力低下，同時還伴有其他認知功能與精神障礙等情況。通常病情進行性加重，在2～3年內喪失獨立生活能力，10～20年左右因并發癥而死亡，對患者的身體健康和生活質量造成嚴重的影響[1]。AD的主要病理改變包括：突觸功能障礙、神經細胞外老年斑(Senile plaques，SPs)、細胞內Tau蛋白變性、神經原纖維纏結(Neuron fiber tangles，NFTs)、神經遞質異常以及線粒體自噬功能障礙等[2]。β位淀粉樣前體蛋白裂解酶-1(β-site APP cleaving enzyme 1，BACE-1)可通過裂解生成β淀粉樣蛋白(Amyloid beta peptide，Aβ)，而Aβ是老年斑的主要成分，其在異常沉積是AD發病的始動環節[3-4]。AD的發病可通過腦缺血或卒中而引起，一般情況下在細胞和動物模型中，由于其缺血或低氧可導致Aβ與BACE-1水平異常升高[5]。芝麻素(Sesamin)是從芝麻中提取的一種木脂素類化合物，是芝麻的主要活性物質。作為一種抗氧化劑，芝麻素具有保護肝臟、抗化學物質所致腫瘤、抗氧化應激和抗炎等作用[6]。芝麻素能減輕腦缺血和帕金森病模型所致的氧化應激和神經炎癥損傷[7-8]，但少見芝麻素對低氧條件下神經元Aβ和BACE-1表達的報道。PC12細胞即大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株，該細胞株來自能移植的雄性大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，這些細胞能夠表達神經生長因子[9]。本文探討了芝麻素對低氧條件下PC12細胞Aβ和BACE-1的表達的影響，以明確芝麻素緩解腦損傷的作用效果與機制，現總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 芝麻素由陜西省中醫藥研究院藥理實驗室提供。二甲基亞砜(DMSO)(博士德公司，武漢)。10%馬血清，5%胎牛血清的RPMI-1640培養基，青、鏈霉素雙抗(GIBCO公司，美國)，Aβ1-42酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(USCN公司，武漢)，BACE-1抗體(Abcam公司，美國)，雙氣、三氣細胞培養箱(Thermo Scitific公司，美國)。

1.2 細胞培養與分組 PC12細胞(重慶醫科大學神經實驗中心，購自中科院上海生物所)培養于RPMI-1640完全培養基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養。取對數生長期的PC12細胞，隨機分為正常氧組與低氧組、低氧加芝麻素0.5、5和50 μmol/L濃度干預組。正常氧組在37 ℃、5%CO2培養箱進行培養。低氧組、低氧加芝麻素0.5、5和50 μmol/L濃度干預組轉移至37 ℃、1%O2、4%CO2、95%N2的三氣低氧培養箱中進行培養，然后分別加入DMSO配制的芝麻素，使培養液芝麻素終濃度為0.5、5、50 μmol/L。

1.3 ELISA檢測Aβ1-42 收集所有組別的培養液，經過離心后取其上清液，其余操作步驟嚴格按照ELISA說明書進行，首先配制出不同稀釋濃度Aβ1-42標準品，設置標準孔、空白對照孔，樣品孔，分別加入不同濃度的標準液和樣品，各100 μl，覆膜加入100 μl的檢測溶液A，進行孵育洗滌后再添加100 μl的檢測溶液B，再次經過孵育、洗滌，然后將酶標板甩干，加入90 μl的底物溶液，將其覆膜后進行避光顯色處理，測定OD450值，繪制標準曲線，計算Aβ1-42分泌值。

1.4 Western blot檢測BACE-1蛋白 收集獲得的PC12細胞，采用全蛋白提取試劑盒提取各組蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣量為20 μg，進行SPS-PAGE電泳，然后將蛋白轉印至PVDF膜上，利用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入BACE-1一抗(稀釋比1∶5000)，4 ℃條件下過夜：二抗37 ℃培養2 h；TBST洗滌，ECL發光，應用Bio-Rad凝膠圖像成像系統采集圖像，Quality One軟件進行掃描分析。GAPDH作為內對照。每組實驗重復3次。

2 結 果

2.1 各組PC12細胞Aβ1-42表達水平比較 低氧組的Aβ1-42表達水平顯著高于正常氧組(P<0.05)；在不同濃度芝麻素(0.5、5和50 μmol/L)干預后，Aβ1-42表達水平顯著下降(均P<0.05)，且呈現濃度依賴性(均P<0.05)。見圖1。

2.2 各組PC12細胞BACE-1蛋白表示水平對比 低氧組的BACE-1蛋白相對表達水平顯著高于正常氧組(P<0.05)；在不同濃度芝麻素(0.5、5和50 μmol/L)干預后，BACE-1蛋白相對表達水平顯著下降(均P<0.05)，且呈現濃度依賴性(均P<0.05)。見圖2。

3 討 論

AD是一個與增齡有關的、具有多病理生理特征的復雜疾病，包括以進行性腦神經元丟失和萎縮為特征的神經變性、腦細胞外β淀粉樣蛋白聚集形成淀粉樣斑塊、腦神經元內Tau蛋白異常磷酸化和聚集形成“神經纖維糾纏結”、腦葡萄糖代謝下降、膠質細胞激活和神經炎癥等。當前，AD已經成為嚴重威脅老年健康及生活質量的神經變性疾病，其也對患者自身、家庭以及社會產生了不可估量的傷害[10-11]。在65歲以上人群中，西方約有5%的人患有此病，85歲以上老年人患病率高達47%～50%，為歐美國家老年期癡呆的主要原因；日本的患病率低于西方，為4%；我國60歲以上人群AD的患病率為3%～5%。但目前對于AD發病的具體原因還不完全明確，除了只有1%的家族性AD可能會與遺傳相關外，目前仍舊是世界性難題。約99%的AD患者為晚發、散發型癡呆，其影響因素包括糖尿病、高血脂、外傷、缺血等[12-14]。

AD與血管性癡呆在缺血性腦血管病、腦低氧環境下以及腦卒中老年患者等影響下的發病率會明顯升高[15]。在腦卒中過程中，低氧損害主要是通過腦低灌注、呼吸暫停導致的，而低氧與Aβ聚集、Tau蛋白磷酸化、血腦屏障損傷、神經元變性等有關[16]。Aβ是細胞膜上的淀粉樣前體蛋白的生成(Amyloid peptide precussor，APP)，在AD發病中起到核心作用，該結果已被人們廣泛認可，神經纖維纏結的形成、氧化和脂質過氧化、谷氨酸能興奮性毒性反應、炎癥和凋亡細胞死亡級聯反應的激活，都被視為繼發于Aβ生成和聚積的后果。Aβ肽聚集可形成神經毒性的原纖維，進而組成AD的病理特征之一，如老年斑等[17]。該物質主要由蛋白水解酶進行分泌，共分為兩條代謝途徑(α和β)。其中β代謝途徑又稱為淀粉樣代謝途徑，β分泌酶(β-secretase)可導致APP產生毒性作用，小分子的Aβ[18]。BACE-1主要是通過β分泌酶產生，也是Aβ生成過程中的一種限速酶。在AD時，BACE1活性增高，產生過多的Aβ，促進老年斑、Tau蛋白磷酸化等病理改變[19]。

有研究發現低氧通過β-分泌酶和γ-分泌酶的活性增加Aβ的生成，特別是SH-SY5Y細胞BACE-1的mRNA和蛋白水平增高[20]。還有研究顯示在短暫性腦缺血、低氧條件下，實驗大鼠的BACE1較對照鼠增加了67%[21]。本研究發現PC12細胞在低氧干預培養24 h，Aβ水平顯著增高，裂解Aβ的BACE-1蛋白表達也相應增高，表明在低氧損傷時，Aβ水平、BACE-1表達水平上升可導致Aβ沉積明顯提高，這與AD的進展及發病具有一定的相關性。

芝麻素作為芝麻的主要活性成分，是一種天然的木脂素類化合物，廣泛存在與芝麻籽和芝麻油中，隨著人們對芝麻素藥理活性研究的不斷深入，其藥物作用之間被人們重視。研究發現，芝麻素不但具有相當高的營養價值，并且具有抗氧化、抗菌、保肝、調節血脂、穩定血壓以及抑制腫瘤等多種生物學活性[22]。近些年，已有一些科研工作者對芝麻素在保護神經細胞缺血性損傷進行了實驗研究。有學者研究顯示芝麻素可發揮抗ROS的作用，保護低氧損傷的神經元和PC12細胞[23]。本實驗設置0.5、5和50 μmol/L濃度芝麻素干預低氧條件培養的PC12細胞，發現芝麻素降低低氧條件下升高的Aβ1-42、BACE-1蛋白表達，且存在劑量依賴性。還有學者研究表明芝麻素改善可逆大腦中動脈栓塞動物模型鼠的行為損傷，進行體內和體外實驗，進一步驗證了芝麻素具有抗氧化應激和抗炎癥的作用，保護缺血腦組織，降低低氧時PC12和BV-2細胞產生的ROS、細胞激酶和PGE2；同時也可減輕Aβ1-42誘導的細胞毒性物質對PC12細胞的損傷，增加PC12細胞活性和乙酰膽堿釋放[24]。芝麻素通過抑制患者體內的信號通路，降低炎癥因子的表達，增加谷胱甘肽和過氧化氫酶的活性，通過顯著的抗氧化、抗炎癥等作用減輕AD所造成的大腦損傷[25-26]。本研究也存在一定的不足，沒有進行體內研究分析，且沒有對多種細胞進行分析，因此對于本研究結論仍需要大量的實驗進行驗證，將在后續研究中繼續進行探究。

總之，在低氧條件下，PC12細胞Aβ1-42、BACE-1蛋白表達升高，芝麻素降低低氧條件下升高的Aβ1-42，BACE-1表達，本文研究結果具有一定的科學性，為阿爾茲海默病的臨床治療提供一定的參考。