頁巖氣開采壓裂液中非氧化型殺菌劑作用機理及潛在生態風險*

張雯宇 盧培利# 程 勇 丁阿強 周上博 張利蘭 包 凱 毛媛媛 汪 軍 李成龍

(1.重慶大學煤礦災害動力學與控制國家重點實驗室，重慶 400044；2.重慶大學環境與生態學院，重慶 400045；3.中石化重慶頁巖氣有限公司，重慶 408400；4.重慶市環境工程評估中心，重慶 401121；5.重慶市生態環境科學研究院，重慶 401147)

頁巖氣是一種賦存在低滲透性富含有機質頁巖地層中的天然氣。水力壓裂技術的應用使美國率先實現頁巖氣規?；_發。我國頁巖氣資源居世界第一，并已在四川盆地實現規模化開發。水力壓裂技術的關鍵之一是壓裂液(由殺菌劑、交聯劑、減阻劑、緩蝕劑、pH調節劑等復合配制而成的特異性流體)，壓裂液中水占90.8%(質量分數，下同)、支撐劑占8.5%，其余0.7%為殺菌劑等化學添加劑[1]21。盡管占比低，但由于鉆井數量大、單井壓裂液消耗量大，化學添加劑的實際使用量非常巨大。在壓裂液的化學添加劑中，用于抑制地層和管道設備中微生物生長的殺菌劑尤其值得關注，其是壓裂返排水中高濃度溶解性有機碳的主要來源之一，且種類眾多[2]。這些殺菌劑本身及其在環境中的轉化、降解產物不僅對人類健康存在潛在毒性作用，也可能對壓裂返排水的后續生物處理和回用產生不利影響。

在我國環境管理逐漸由污染控制轉向風險防控的背景下，隨著頁巖氣開發范圍和規模的擴大，其快速開發潛存的生態環境影響，尤其是殺菌劑的生態風險引起了廣泛關注[3-4]。然而，我國頁巖氣規模化開發歷時短，有關生態環境影響的認識尚在積累之中。為此，本研究對頁巖氣開采水力壓裂液中典型殺菌劑的使用概況、殺菌機理、典型環境特性、生態毒理效應、潛在生態風險等進行綜述和分析，以期為我國頁巖氣開發使用殺菌劑的生態風險研究和防控管理提供基礎資料。

1 壓裂液中殺菌劑使用概況

頁巖氣開采壓裂液中的殺菌劑可使有害微生物(如硫酸鹽還原菌(SRB)、產酸菌(APB)等)數量降至較低水平，防止管道堵塞、設備腐蝕、氣體減產等，殺菌劑種類繁多，其用法用量也有較大不同。通常，壓裂液中的殺菌劑總質量濃度在500 mg/L以上[5]16，約占壓裂液總質量的0.06%[1]21。壓裂返排水回用于壓裂液后將導致微生物耐受性增強，或微生物因長期暴露于含鹽水而導致耐鹽性提高，都會增加殺菌劑用量。由于目前壓裂液配方的不透明性及檢測方法的局限性給水力壓裂過程的潛在生態風險分析帶來極大挑戰，較大的風險不確定性使得殺菌劑被認為是需優先考慮的頁巖氣相關有機化合物。

按抑制方式，壓裂液中的殺菌劑包括氧化型和非氧化型。氧化型殺菌劑包括氯系列、溴系列、鹵化海因、臭氧、過氧化氫等，可通過反應釋放的自由基攻擊細胞成分進行殺菌，也可直接氧化細菌細胞壁或穿透細胞膜通過氧化胞內的不飽和鍵來殺菌。氧化型殺菌劑由于高效、低價在20世紀70至90年代的石油行業應用廣泛，但由于其持續時間短且存在腐蝕設備、與其他化學品生成副產物等風險而在壓裂液配制中應用有限[6]。

水力壓裂過程中使用的非氧化型殺菌劑以溶胞類和親電子型為主[5]18。溶胞類殺菌劑可通過與細胞膜表面的陰離子官能團結合、對脂質雙分子層進行擾動，使細胞滲透調節能力喪失至最終溶解，以陽離子季銨鹽類化合物(QACs)為主要代表[7],[8]710。親電子型殺菌劑因具有強活性的電子接收官能團(如C=O雙鍵等)而易與富電子基團(如暴露在細菌細胞壁膜蛋白上的硫醇(—SH)和仲胺(—NH))發生反應，從而使細胞壁損傷和細胞質凝固。這類殺菌劑以有機醛類為主，如甲醛、丙烯醛、戊二醛等，其中戊二醛使用頻率最高，在30%以上[9]10252。

非氧化型殺菌劑占壓裂液殺菌劑使用量的72.5%[10]，其中溶胞類殺菌劑QACs持續時間較長，通常與親電子型殺菌劑戊二醛聯用，通過協同作用提高效率，以下主要對QACs及戊二醛的殺菌機理、典型環境特性、生態毒理效應進行概括和分析討論。

2 QACs的殺菌機理、典型環境特性與生態毒理效應

具有殺菌活性的長鏈QACs主要包括芐基烷基二甲基銨化合物(BACs，烷基鏈長C12～C18)、二烷基二甲基銨鹽(DADMACs，烷基鏈長C8～C18)、烷基三甲基銨鹽(ATMACs，烷基鏈長C12～C18)等[11]356。QACs在井下被稀釋、降解、轉化為其他化合物，返排回地面后隨時間推移，其質量濃度可由最初的mg/L級降至μg/L級[12]。OETJEN等[13]檢測到美國某水力壓裂井的壓裂返排水中QACs為1 mg/L；ZHONG等[14]發現加拿大某平臺壓裂返排水中QACs由最初的25 mg/L左右降至0.5 mg/L以下。

2.1 QACs殺菌機理

陽離子型殺菌劑對微生物細胞的影響之一是改變其疏水性，并對脂質雙分子層進行擾動[15]。長疏水性烷基鏈被認為是QACs的主要殺菌基團，它以細菌細胞膜為靶點，帶正電荷的季氮與膜內酸性磷脂頭部基團結合，使細胞表面疏水性變化；同時側鏈疏水尾部交叉進入疏水膜核心靶點位置，最終導致細胞質泄漏和細胞裂解。QACs分子本身并不參與化學反應，僅在細菌細胞膜的脂質雙分子層和表面起到“楔子”和“離子交換器”的作用，故其殺菌機理屬于物理殺菌。

一般來說，QACs可針對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母和絲狀真菌起抑制作用，最佳殺菌碳鏈長為C16、C14、C12[16]。低濃度QACs會占據膜表面上的陰離子位點，與細胞膜內酸性磷脂頭部基團結合而降低雙層膜的流動性，并在膜中形成親水空隙，使細胞失去滲透調節能力，致使鉀離子、質子等流出；中等濃度QACs會擾亂在膜上進行的呼吸、溶質傳遞、細胞壁的合成等作用；高濃度QACs會形成膠束聚集體，直接將疏水性的膜組分(脂質、磷脂等)溶解，破壞基本滲透梯度，最終導致胞內物質泄露和細胞溶解[8]708。部分QACs(如苯扎氯氨)還可借助其正電荷和兩親性來結合并破壞核糖體[17]。

2.2 QACs典型環境特性

目前QACs已經在各類環境中被檢出，地表水和污水處理廠進出水中QACs質量濃度為幾至上千μg/L[18-19]；污泥和沉積物中的QACs則為幾百至上千mg/kg，遠高于與其共存的多環芳烴、有機氯農藥、多氯聯苯等其他有機污染物[20-21]。

QACs的亨利定律常數較低，揮發性較弱，但辛醇-水分配系數和吸著系數較大，呈疏水性，降解半衰期較長，容易通過離子交換、離子對、疏水鍵的吸附作用，在帶負電的污泥、土壤和沉積物中積聚。全球每年生產使用的QACs在70萬t以上，其中約75%最終進入廢水處理系統，部分經由活性污泥吸附和降解去除[22]。α-氧化是QACs生物降解的最主要途徑，雖然脫去N—R+鍵后QACs毒性降低，利于后續降解，但實際降解速率受微生物體內單加氧酶、還原型輔酶活性的限制，且降解產物三甲基銨鹽的積累會影響生物活性和去甲基化速率進而影響轉化過程[23]。普遍認為QACs的降解速率與烷基鏈長度負相關，在15 mg/L的起始質量濃度下，十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨的生物降解率分別為52.4%、13.6%、8.3%[24]。QACs較差的生物可利用性與其自身化學結構、環境濃度、與陰離子表面活性劑絡合程度、溶解氧濃度和微生物類型/活性等因素有關[25]，如含苯基QACs需經歷額外去芐基過程使其降解速率比普通QACs低[26]；厭氧環境下QACs幾乎不發生生物降解；好氧生物降解率隨非甲基烷基的增加而降低，且由于中間產物(芐胺等)對微生物的抑制作用而降解不完全[27]；QACs的質量濃度高于10 mg/L時會抑制污泥硝化作用(特別是亞硝酸鹽氧化過程)[28]。因此，在活性污泥系統中，QACs的生物降解甚微，主要通過吸附至污泥而去除。有研究發現，典型苯基QACs苯扎氯銨在3 h的吸附率達40%，4 d的吸附率可達90%，吸附作用強度與QACs的結構及固相顆粒的理化性質有關[29]。

2.3 QACs生態毒理效應

水生生態系統中不同營養級的生物對QACs敏感性具有較大不同。QACs在96 h暴露時間內對藻類等初級生產者的半最大效應質量濃度(EC50)為20～200 μg/L、對水蚤等初級消費者的EC50為20～90 μg/L、對魚類等次級消費者的EC50為40～280 mg/L[30-31]。QACs的EC50與其碳鏈長度、極化度等因素有關。由于持續輸入與不斷積累，頁巖氣開采區域和污水處理廠排水口附近的水生生態環境中可能存在較高濃度的QACs，水生生物始終暴露于該環境下會引發潛在生態風險。水體中QACs大于10 mg/L或沉積物QACs大于50 mg/kg時將抑制活性污泥、土壤中微生物呼吸酶、脫氫酶活性，并使硝化反應受阻[11]358。盧培利等[32]發現，苯扎氯氨對以氮源為基質的活性污泥微生物的硝化活性存在抑制，最低抑制質量濃度為6 mg/L，并通過擬合殺菌劑濃度與抑制率曲線得出苯扎氯氨對活性污泥的半抑制質量濃度(IC50)為19.35 mg/L。目前環境中QACs濃度水平相對較低，但微生物已有抗藥性趨勢[33-34]。而對頁巖氣開采所用壓裂液來說，若其中的懸浮顆粒、乳化油珠等負電性的物質過多，QACs與之進行相互作用后會降低殺菌活性，且長期單獨使用易產生抗藥性。

QACs也是對哺乳動物細胞毒性最大的表面活性劑之一，可抑制線粒體呼吸作用、減緩氧化磷酸化、改變DNA結構進而使細胞凋亡[35]。部分哺乳動物口服QACs的半數致死量(LD50)分別為：大鼠250～1 000 mg/kg、小鼠150～1 000 mg/kg、豚鼠150～300 mg/kg、兔子和狗500 mg/kg[36]61。長期接觸QACs的小鼠，其繁殖健康受到嚴重損害，且吸入QACs氣溶膠后對小鼠肺部產生影響[37]。QACs對不同動物均表現出相似的皮膚刺激性，當溶液中QACs質量分數低于0.1%時不會對皮膚產生影響，但QACs達0.3%以上即可引起從皮膚刺激到壞死的各種反應[36]62。QACs對暴露的真核細胞具有潛在的遺傳毒性作用，直接接觸含有QACs的洗滌劑和高含量的QACs藥物，可能會對人體造成潛在的DNA損傷效應[38-39]。

歐盟已在2000年將QACs列入優先污染物名單，但目前針對壓裂返排水中QACs的研究十分有限，考慮到QACs對生態系統和人類健康的潛在危害，相關研究值得進一步加強。

3 戊二醛的殺菌機理、典型環境特性與生態毒理效應

3.1 戊二醛殺菌機理

戊二醛具有生物降解性和自聚合趨勢，在高溫、堿性的頁巖氣井下和地層環境中可迅速發生聚合，并沉淀出較大的聚合物[40]，因而在返回地表的壓裂返排水中，戊二醛可能被完全耗盡或僅以水溶性低聚物形式存在。戊二醛可通過羥醛縮合、Michael加成等方式與細胞內成分如核酸、蛋白質等發生反應，使巰基、羥基、羧基和氨基等烷基化[41]。按作用靶點和細菌細胞結構的不同，戊二醛殺菌機理包括與細胞蛋白質及酶的作用、與肽聚糖的相互作用、與細胞質組分的相互作用。

具有高反應活性的戊二醛可與細菌等微生物的細胞壁、細胞膜氨基交聯，從而損傷細胞壁并使細胞質凝固，抑制DNA合成[42]。但由于細胞壁/膜的屏障保護作用，戊二醛及其多聚物很難在沒有主動運輸、基團轉位的情況下進入細胞內部。因此，戊二醛更多地是與肽聚糖反應來實現殺菌。戊二醛與胺、巰基間存在相互作用，可能對細胞壁暴露、缺乏保護層的有機體更具毒性。戊二醛穿透力差，在與QACs結合使用后可增強滲透力，提高殺菌活性，因此廣泛應用于頁巖氣壓裂液的配制。

3.2 戊二醛典型環境特性

戊二醛在土壤和沉積物中的吸著系數分別為380、120[43]30，介于中高遷移水平(吸著系數50～ 500)，因此其在兩種介質中遷移率相對較高；戊二醛辛醇-水分配系數較低[44]，水溶性較高，故戊二醛具有較低的生物蓄積趨勢，更傾向于保持在水相中。與QACs相比，戊二醛的生物可利用性更強，在好氧、厭氧條件下均可被微生物快速轉化，準一級半衰期分別為10.6、7.7 h[43]35。在好氧條件下，戊二醛可先被微生物代謝為中間體戊二酸，再轉化為二氧化碳；厭氧條件下先轉化為5-羥基戊醛，再轉化為1,5-戊二醇[45]。戊二醛在環境中的實際降解速率與其自身濃度水平和細菌的適應情況有關。

MCLAUGHLIN等[46]對頁巖氣開發壓裂液中殺菌劑對農業土壤的污染進行了模擬研究，結果顯示戊二醛與土壤中胺官能團交聯后會被快速吸附，而后通過耐鹽微生物體的代謝及與細胞共價結合兩種方式被去除。戊二醛對SRB的最低抑制質量濃度為20 mg/L，但當其質量濃度超過5 mg/L時即會抑制污水處理中微生物活性，并對處理性能產生不利影響[43]31。雖然戊二醛無累積效應，但可抑制其他污染物的生物降解。在頁巖氣開發壓裂液的使用濃度水平下，戊二醛對其他化合物的生物降解抑制速率隨戊二醛濃度的增加而增大[9]10251。由于戊二醛常與其他殺菌劑聯合使用，這些化合物的聯合毒性作用以及可能轉化形成更強毒性的副產品等是值得關注的問題。

3.3 戊二醛生態毒理效應

由于可被生物降解，且降解速度較快，戊二醛的生態影響潛力相對較小。在水生生態系統中，戊二醛在96 h暴露時間內對浮萍、藻類等初級生產者EC50為0.17～73.80 mg/L；對水蚤、牡蠣、端足蟲等初級消費者EC50為0.75～289.00 mg/L；對斑馬魚、虹鱒魚等次級消費者EC50為1.8～40.0 mg/L[47-49]。在戊二醛溶液中持續暴露21 d后，大型溞在0.21、1.06 mg/L下死亡率分別為10%、20%，而水蚤在4.25 mg/L下可全部存活，但出現明顯繁殖抑制；魚類在2.9 mg/L戊二醛溶液中暴露32 d后，出現幼體存活率降低現象[43]28。

戊二醛被認為具有潛在的致癌作用，雖然體外/體內生物測試方法沒有發現其明確的遺傳毒性[50]，但卻具有一定發育毒性，對大鼠的出生活仔率、存活總數和牡蠣胚胎的存活率等均有影響[51]。根據體外實驗研究，戊二醛可使細菌和一些培養的哺乳動物細胞系統產生DNA損傷，經戊二醛處理的牛心包會引起明顯的毒性，出現炎癥和鈣化反應[52]。

4 頁巖氣水力壓裂過程中殺菌劑潛在生態風險

頁巖氣開發的水力壓裂過程可能會帶來地下水、地表水、大氣、土壤污染以及生態風險。但目前對頁巖氣等非常規天然氣開采的生態風險評估尚不成熟，正處于以常規油氣風險評估為基礎不斷完善的階段。自2010年起，國內外開始對頁巖氣開采過程的生態風險進行評估，美國環境保護署(USEPA)通過對有關情景評估、實驗室研究、毒性評估和案例研究等數據的收集，評估了水力壓裂對飲用水資源的風險[53]；SUN等[54]在對頁巖氣開發各環節的環境影響進行調查后，采用關聯矩陣法對影響進行了評價，并建立了一個自然生態環境與外部宏觀環境的綜合評價體系；ZIEMKIEWICZ等[55]使用事件樹，對運輸過程中的頁巖氣水力壓裂流體在不同污染途徑下的環境和公共風險進行了概率分析；張虹[56]通過構建頁巖氣開發風險概率模型，實現了對生態風險的定量表征，并提出了基于“源—路徑—目標”的地表水污染風險評價方法；高曉斐[57]運用層次分析法、模糊綜合評價法等對風險指標及所對應風險值進行量化，構建了一套頁巖氣開采風險評價模型。但總體來說，頁巖氣開采過程風險評估存在基礎數據和評估方法上的不足。將實際化學污染物的潛在風險評估納入其中，可更完整地實現對受頁巖氣開發所影響區域的生態風險評價。

可用于殺菌劑生態風險評價的方法包括熵值法、暴露-反應法、污染指數法、回歸過量分析法[58]等，需要同時結合污染物的理化性質、生態毒理學特性和生態證據線來進行客觀評價。BUTKOVSKYI等[59]將水力壓裂化合物在地表水中的濃度預測值與不影響水中生物的濃度值進行比較，判定是否對環境有潛在風險；USEPA采用多標準決策框架，從化合物的相對毒性、檢出概率、物理化學性質(流動性、揮發性、持久性等)3方面對壓裂液、壓裂返排水中的化合物進行評分，對水力壓裂污染物的潛在危害進行分析。

目前阻礙殺菌劑開展生態風險評估的問題有：(1)殺菌劑等水力壓裂化合物的具體使用濃度、頻率、使用量等數據缺失。目前關于殺菌劑在井筒、儲存池、各類廢水處理系統中的存在形態、轉化和濃度水平，以及進入環境的劑量等仍缺乏認識，壓裂液、壓裂返排水成分復雜，檢測依然存在挑戰。(2)水力壓裂現場環境介質多樣，物質存在多種遷移轉化過程，很難確定其最終去向與影響范圍。釋放到環境中的殺菌劑可通過地表徑流和地下徑流造成污染。在低滲透性土壤區域，殺菌劑主要通過較大的徑流作用到達附近水域，使地表水受到污染，并進一步通過地層間縫隙進入含水層，造成地下水污染；在高滲透性土壤區域，殺菌劑被吸附到土壤顆粒中或存在于土壤顆粒的孔隙間，使土壤受到污染；降水可進一步促使污染物的溶解，使其向地下水遷移。另外，被灌注至地下的壓裂返排水及被滯留的壓裂液可能通過巖石裂隙等向上移動，逐漸滲入含水層，對地下水造成污染。(3)現場實際生態參數難以評估。以地下水為例，雖然其樣本可作為地表水環境中或土壤、沉積物孔隙中有機物暴露的替代物，但缺乏相關生物的數據，很少進行地下水毒性試驗，難以掌握地下水生態系統的真實敏感性。

5 結論與展望

頁巖氣開采壓裂液中多使用非氧化型殺菌劑，其中QACs和戊二醛應用最為廣泛。兩種殺菌劑常聯合使用以增強滲透力、提高殺菌活性。QACs、戊二醛及其轉化產物均具有毒性效應，能夠抑制其他化合物的生物降解，其對微生物的抗性作用還會影響壓裂返排水回用。

壓裂液中殺菌劑具有潛在生態風險，基于典型單一條件下的物理化學和毒理數據難以代表高溫、高壓、高鹽等復雜條件下的殺菌劑的實際形態、轉化過程和毒理效應。因此，對頁巖氣開采業殺菌劑的潛在生態風險展開評估，需先克服當前殺菌劑使用信息(使用量、使用頻率、濃度)的不對稱、壓裂返排水檢測方法的不完善、殺菌劑在頁巖氣開發區域環境介質中的遷移轉化過程的不確定性。后期研究應結合殺菌劑理化性質、生態毒理學特性和生態證據線來對其在不同介質中的遷移過程進行模擬，分析遷移距離、影響范圍，從而更全面地實現殺菌劑的生態風險分析，為制定針對性防范措施提供理論基礎。

隨著我國環境風險管理要求日益嚴格，未來應進一步完善頁巖氣開采行業的生態風險形成機制和評估方法，并對我國現有水污染控制標準和壓裂返排水處理處置技術工藝控制生態風險的能力進行評估，以服務我國頁巖氣的安全、綠色持續開發。