稻谷霉菌的分離鑒定及其對稻谷品質的影響研究

李 娜 周紅麗 張 兵 周 濤 任劍豪 宗 平 吳衛國

(湖南農業大學食品科學技術學院1，長沙 410128)(中南糧油食品科學研究院有限公司2，長沙 410008)

稻谷是我國主要的糧食作物之一，全國各地都有稻谷的種植產區，年總產量逾2億t[1]。稻谷的儲藏期一般為3年。儲藏過程中，微生物在適宜的環境條件下滋生，容易引起儲藏稻谷發霉、腐爛和變色，直接或間接地影響儲藏稻谷的質量[2]。尤其是在高水分稻谷中，霉菌生長快速，導致稻谷迅速劣變[3]，一些不明顯的霉菌毒素危害甚至可影響動物生殖系統[4-6]。

稻谷在儲藏過程中，其品質主要受到溫度和水分的影響，儲糧溫度越高、水分含量越高，稻谷霉菌量越大，而水分含量又是真菌生長的決定性因素，當水分含量在霉菌生長臨界水分以下，即使溫度適宜，霉菌也不會生長[7]。何榮等[8]研究發現，黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)以及產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)最易導致稻谷結塊，此外結塊稻谷的出糙率、整精米粒率較低，并且不完善粒率明顯增加。儲藏期間，儲糧上帶有的霉菌種類較多，主要是曲霉屬和青霉屬[9]，有研究發現稻谷中主要優勢霉菌為黃曲霉、灰綠曲霉、白曲霉和黑曲霉，其中黃曲霉、黑曲霉大多分布于糧倉上層，白曲霉在下層分布較多，灰綠曲霉則普遍分布于糧倉各層各方位[7]。現階段仍舊主要依據霉菌的菌落情況和顯微結構特征[10,11]，參考菌落、菌絲和孢子的形態觀察對霉菌進行鑒定[12]。在此研究背景下，通過對主要霉菌純化培養，利用分子生物學方法對優勢菌種進行鑒定，并研究了霉菌對稻谷品質的影響，為稻谷安全儲藏與防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

早秈稻：湖南省常德市金牛糧倉7P5倉，入庫年份為2018年。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、無水乙醇(分析純)、氫氧化鉀標準滴定溶液(0.500 0 mol/L)、酚酞指示劑、氯化鈉(分析純)、美蘭染色液、TSINGKE DNA凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)、rTaq酶(Taq DNA聚合酶)、PCR Mix、測序試劑ABI-bigdye。

1.2 主要儀器設備

SW-CJ-1D超凈工作臺，MJ-150-11霉菌培養箱，LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器，JLGJ45檢測礱谷機，JFSD-100-Ⅱ電動粉碎機，202電熱恒溫干燥箱，HY-4調速多用振蕩器，3730XL測序儀(ABI,Foster,CA,USA)，SMA4000微量分光光度計，DYY-6C電泳儀，PCR反應擴增儀，FR980凝膠成像分析系統。

1.3 實驗方法

1.3.1 稻谷樣品采集

2019年9月6日進行第一次取樣，此后每兩個月取樣一次，共取樣3次。采用五點三層取樣，分別以距糧堆表面2.4、3.6、4.8 m為上層、中層、下層。以距糧倉東南角、東北角、西南角、西北角1.5 m處及糧倉中央點作為取樣點，每一個點位取上、中、下三層的稻谷，共取15份樣品，每份樣品取1 kg，用無菌取樣袋密封取回，于實驗室中低溫避光保存。對每一層的取樣點、及整個糧倉的取樣點所取樣品，各稱取100 g于無菌均質袋中，分別用于每一層的混樣和糧倉總混樣的檢測[13]，取樣點位如圖1所示。

圖1 稻谷取樣點位圖

1.3.2 霉菌菌種鑒定

1.3.2.1 霉菌菌種初步鑒定

將霉菌接種在PDA培養基中，放置在28 ℃恒溫培養箱中培養5 d，并用劃線法對霉菌進行分離純化，得到的霉菌，根據菌落的培養特性和顯微特征對菌種進行初步鑒定；霉菌培養特性的觀察：根據霉菌的生長速度、培養時間，以及其菌落顏色、氣味、形態等，對其進行初步判斷。

霉菌顯微特征鑒定：挑取菌落邊緣的氣生菌絲，制片。將其置入顯微鏡下，觀察其是有性或是無性繁殖、營養菌絲的情況以及形態和大小，著重觀察其菌絲形態及其分生孢子頭的形態，根據霉菌的顯微特征對其進行初步鑒定[10]。

1.3.2.2 霉菌菌種鑒定

模板處理：挑取菌體變性處理后，離心取上清為模板，選擇相應引物擴增測序驗證。

PCR擴增回收：利用引物ITS1/ITS4進行PCR 擴增，引物序列：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 擴增體系與程序見表1和表2。

表1 PCR反應體系

表2 PCR反應程序

使用TSINGKE DNA凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)切膠回收目的片段以相應引物測序。測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST比對，從中選取同源性高的菌株，再使用MEGA7.0軟件，構建系統進化樹。

1.3.3 稻谷品質檢測指標及其測定方法

霉菌量測定參照GB 4789.15—2016[14]；稻谷出糙率的測定參照GB/T 5495—2008《糧油檢驗 稻谷出糙率檢驗》[15]；脂肪酸值的測定參照GB/T 20569—2006《稻谷儲存品質判定規則》[16]；整精米率檢驗參照GB/T 21719—2008《稻谷整精米率檢驗法》[17]。

2 結果與分析

2.1 稻谷中霉菌的鑒定

2.1.1 霉菌的篩選

對湖南常德儲糧糧倉中的稻谷進行定點定時取樣，經過三次取樣對比，選取了菌落狀態、顏色等不同的13種霉菌，暫標記為A、B、C、D、F、I、J、K、L、M、O、P、Q，通過菌株分離及5次純化得到13種霉菌的純培養物，并于4 ℃環境保存。

2.1.2 霉菌的形態特征分析及菌種鑒定

經過霉菌形態學對比和測序見表3、表4，可知A、B、C、D、F、I、J、K、L、M、O、P、Q菌株所對應的霉菌分別為：RhizopodiformisisolateHX-1、AspergillusoryzaeisolateNL5、LichtheimiaramosastrainAUMC7961、AspergillusnigerisolateSZ8M-14、AspergillusfumigatusstrainJXL-108Y-1、AspergillusflavusisolateL-4932013、RhizomucorpusillusstrainCNM-CM5124、AspergilluscandidusstrainHDN15-152、PenicilliumcitrinumstrainNSF4、Aspergilluscristatus、PenicilliumislandicumculturecollectionMUCL14074、Aspergilluscristatusstrain33YH-WZ-18、RhizomucorpusillusstrainAUMC7966。

表3 霉菌的形態特征分析

表4 霉菌菌種鑒定

霉菌DNA提取及擴增結果見圖2。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳

采用真菌通用引物分別對13種霉菌菌株高度保守序列區域進行PCR擴增，由圖2可看出，DNA條帶清晰、單一，說明分離純化得到的是純培養物，不存在同源區結合位點，提取的DNA純度較高，最終DNA經PCR擴增后純度很高。在NCBI上對比后選擇同源性較高的菌株并構建系統進化樹[28]。

2.2 霉菌對稻谷品質的影響

2.2.1 不同層位稻谷霉菌及其品質的變化

由圖3～圖7可知，同一糧倉不同取樣糧層間稻谷的水分含量、霉菌量、出糙率、整精米率、及脂肪酸值均存在顯著性差異(P<0.05)。含水量、霉菌量、脂肪酸值隨著儲存時間的延長，逐漸上升，均呈上層>中層>下層的趨勢，出糙率及整精米率則為下層>中層>上層，隨著儲存時間的延長，逐漸下降。對比各糧層霉菌的變化量，可推測稻谷含水量增加，有利于稻谷霉菌的生長。

注：不同字母表示同一糧倉稻谷不同層位間差異顯著(P<0.05)。余同。

圖4 稻谷不同層位霉菌量變化規律

圖5 稻谷不同層位出糙率變化規律

圖6 稻谷不同層位整精米率變化規律

圖7 稻谷不同層位脂肪酸值變化規律

2.2.2 不同點位稻谷霉菌及其品質的變化

由圖8～圖12可知，同一糧倉不同取樣點位間稻谷的含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、及脂肪酸值均存在顯著性差異(P<0.05)。由圖8可知，糧倉4號和5號點位稻谷水分含量較高，且由圖9可知，稻谷的霉菌量隨著儲存時間的延長是不斷上升的，其中4號和5號點位稻谷霉菌量最多，也說明了稻谷水分含量對稻谷霉菌量的積極影響。另每個點位數據均為將該點位三層稻谷的混合樣檢測所得。稻谷品質的指標檢測結果如圖10～圖12所示，隨著時間的延長，糧倉5個點位的出糙率和整精米率均存在下降的趨勢，與霉菌量的變化趨勢相反，該結果表明稻谷在儲藏過程中品質發生了一定的劣變，而霉菌的增長則可能是導致稻谷品質下降的主要因素；糧倉5個取樣點位稻谷的脂肪酸值出現了逐漸上升的趨勢，變化趨勢與霉菌量的變化相同，其中4號、5號點位稻谷脂肪酸值上升幅度較大，對比其霉菌變化量，可推測，霉菌量的變化對脂肪酸值的影響較大，且脂肪酸值越高，稻谷品質則越低[8]。

圖8 稻谷不同點位含水量變化規律

圖9 稻谷不同點位霉菌量變化規律

圖10 稻谷不同點位出糙率變化規律

圖11 稻谷不同點位整精米率變化規律

注：不同字母表示同一糧倉稻谷不同點位間差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、脂肪酸值的相關性分析

采用相關性分析法對稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率及脂肪酸值進行分析，結果見表5。

表5 稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、脂肪酸值的相關性

由表5可知，第一次取樣稻谷，含水量與霉菌量、脂肪酸值，出糙率與整精米率均呈極顯著正相關(P<0.01)。水分含量、霉菌量與整精米率均呈顯著負相關(P<0.05)。霉菌量與脂肪酸值呈顯著正相關(P<0.05)；第二次取樣稻谷，含水量與霉菌量，出糙率與整精米率均呈顯著正相關(P<0.05)。含水量、霉菌量與整精米率均呈極顯著負相關(P<0.01)。霉菌量與出糙率呈極顯著負相關(P<0.01)；第三次取樣稻谷，含水量與霉菌量、脂肪酸值均呈顯著正相關(P<0.05)。霉菌量與整精米率呈極顯著負相關(P<0.01)，與脂肪酸值呈極顯著正相關(P<0.01)。

結果表明稻谷出糙率、整精米率、脂肪酸值均受霉菌量與水分含量的影響，而稻谷水分含量對霉菌量也有一定的影響。稻谷整精米率及出出糙率高，表明其品質相對較好,原因在于出糙率表示的是稻谷中可食用部分占稻谷籽粒總質量的比例，整精米率表示稻谷能夠加工出整粒大米產品占稻谷籽粒總質量的比例,我國現行GB 1350—2009《稻谷》和GB/T 17891—1999《優質稻谷》中，出糙率、整精米率均是品質指標[29]。而脂肪酸值則相反，稻谷的脂肪酸值表示其所含游離脂肪酸的多少，隨著稻谷儲存年限增長，脂肪酸值呈上升趨勢，而稻谷新鮮程度與其游離脂肪酸的含量存在一定的關系[30]。稻谷脂肪酸值會隨著稻谷中霉菌量的增加而增加，稻谷出糙率與整精米率則會隨霉菌量的增加而降低，說明稻谷霉菌對其品質的劣變具有積極作用。

3 結論

通過對分離純化得到的13種霉菌的形態特征分析及分子生物學鑒定，初步判定13種不同霉菌分別為：A:RhizopodiformisisolateHX-1、B:AspergillusoryzaeisolateNL5、C:LichtheimiaramosastrainAUMC7961、D:AspergillusnigerisolateSZ8M-14、F:AspergillusfumigatusstrainJXL-108Y-1、I:AspergillusflavusisolateL-4932013、J:RhizomucorpusillusstrainCNM-CM5124、K:AspergilluscandidusstrainHDN15-152、L:PenicilliumcitrinumstrainNSF4、M:Aspergilluscristatus、O:PenicilliumislandicumculturecollectionMUCL14074、P:Aspergilluscristatusstrain33YH-WZ-18、Q:RhizomucorpusillusstrainAUMC7966。其中B:AspergillusoryzaeisolateNL5與I:AspergillusflavusisolateL-4932013的菌落顏色、形態較為相似，肉眼觀察時，可根據菌落背面顏色區分，B:AspergillusoryzaeisolateNL5的菌落背面顏色為深黃色，I:Aspergillus flavus isolate L-4932013則為白色或米黃色。

實驗發現隨著稻谷霉菌的增長，稻谷的出糙率和整精米率均下降，與第一次取樣相比，最后一次取樣的5個點位稻谷出糙率分別下降了0.71%、1.69%、2.51%、2.94%、1.80%，整精米率分別下降了0.49%、6.13%、8.72%、7.56%、8.68%，脂肪酸值分別增加了7.44%、14.10%、0.13%、25.31%、22.19%；采用相關性分析法對不同糧倉稻谷的水分含量、霉菌量、出糙率、整精米率及脂肪酸值進行分析，發現稻谷含水量、霉菌量與整精米率、出糙率均呈顯著負相關(P<0.05)，與脂肪酸值呈極顯著(P<0.01)和顯著正相關(P<0.05)，進一步說明稻谷水分含量和霉菌量對稻谷品質的劣變具有一定的積極作用。