微波輔助堿液提取花生殼黃酮工藝

谷政偉 李 丹 樊蘇萍 劉智超 厲志偉

(湖南航天天麓新材料檢測有限責任公司，長沙 410004)

花生(ArachishypogaeaL.)系豆科落花生屬植物[1]，原產(chǎn)于南美洲一帶，約在16世紀傳入中國。現(xiàn)今，我國的花生種植規(guī)模已居世界前列[2]。花生殼作為花生生產(chǎn)的附屬物，大部分被用作燃料或直接丟棄，導(dǎo)致浪費及環(huán)境污染[3]。花生殼含有黃酮，楊增明等[4]發(fā)現(xiàn)我國不同產(chǎn)地的花生殼黃酮含量在0.25%～1.42%之間；且已有科研人員從花生殼浸出液中分離出若干黃酮單體[5,6]。黃酮作為天然活性物質(zhì)，具有抑菌、消炎、抗氧化和抗腫瘤等多種功能[7-11]，在醫(yī)藥、化妝品、食品和保健品中的應(yīng)用有較大的潛能。

目前，從花生殼中提取黃酮的技術(shù)有溶劑提取、微波輔助、超聲波輔助、酶輔助、高壓脈沖電場輔助和協(xié)同輔助等[3,12]。堿液提取是利用黃酮分子多數(shù)含酚羥基，顯弱酸性，易溶于堿性水的性質(zhì)[13]。微波輔助技術(shù)省時、節(jié)能，具有易控制和提取得率較高等優(yōu)點[14,15]，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取。目前，關(guān)于微波輔助提取花生殼黃酮的文獻，所使用的提取溶劑多數(shù)是乙醇溶液，使用堿液作提取溶劑的報道鮮見[3]。黃酮的提取是后續(xù)分離純化及活性探究的前提；迄今，關(guān)于花生殼黃酮提取工藝的報道，少有對提取物進行純度檢測。本文擬采用氫氧化鈉水溶液當提取溶劑，以微波作輔助技術(shù)提取花生殼黃酮，用鹽酸酸化浸出液，使黃酮沉淀析出，并對黃酮粗品進行純度測定，以期為花生殼的進一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木犀草素標準品(純度：HPLC≥98%)、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁和鹽酸均為分析純。花生殼取自湖南省長沙市郊區(qū)。

1.2 實驗儀器

BJ-800A中藥粉碎機，PyNN130745微波萃取儀，UV 3010紫外-可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制作

按參考文獻[16]中的AlCl3法操作。

1.3.2 工藝流程

將花生殼洗凈，在50 ℃條件下烘干，粉碎，過60 目篩。稱取花生殼粉末，放入提取罐，加入一定體積的氫氧化鈉水溶液(pH值分別是10、11、12、13、14、15)。把提取罐放入微波萃取儀，設(shè)定提取溫度和提取時間參數(shù)。待提取完畢，過濾，收集濾液。當濾液冷卻后滴加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH使黃酮沉淀析出，之后靜置24 h。過濾，把得到的固體在50 ℃條件下烘干得到花生殼黃酮粗品。

黃酮提取得率按式(1)計算：

(1)

式中：ρ為黃酮提取得率/%；c為檢測液中的黃酮濃度/μg/mL；f為稀釋倍數(shù)；m為花生殼樣品的質(zhì)量/g；v為定容體積/mL。

黃酮純度按下式計算：

(2)

式中：w為黃酮純度/%；c為檢測液中的黃酮濃度/μg/mL；f為稀釋倍數(shù)；m為黃酮粗品的質(zhì)量/g；v為為定容體積/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溶劑pH對黃酮提取得率的影響

固定花生殼粉末20.00 g、液料比10∶1 mL/g、提取溫度50 ℃、提取時間5 min和酸沉pH 4.0，探討提取溶劑pH分別為10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0時，對黃酮提取得率的影響。

由圖1可知，當提取溶劑pH小于12.0，黃酮提取得率隨著提取溶劑pH增大而升高，這是因為大多數(shù)黃酮，例如木犀草素、香葉木素和圣草酚，含有酚羥基，顯弱酸性，可與氫氧化鈉反應(yīng)生成易溶于水的鹽類，從而促進細胞內(nèi)的黃酮轉(zhuǎn)移至提取溶劑當中。當提取溶劑pH大于12.0，黃酮提取得率隨著提取溶劑pH增大而降低，這是因為當提取溶劑pH超過一定值，黃酮母核會遭到破壞，同時易溶于堿性溶液的雜質(zhì)與黃酮進行競爭[17]，抑制細胞內(nèi)的黃酮溶入提取溶劑當中。因此在后續(xù)的單因素實驗中，將提取溶劑pH定為12.0。

圖1 各因素對花生殼黃酮提取得率的影響

2.1.2 液料比對黃酮提取得率的影響

固定花生殼粉末20.00 g、提取溶劑pH 12.0、提取溫度50 ℃、提取時間5 min和酸沉pH 4.0，探討液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g時，對黃酮提取得率的影響。

由圖1可知，當液料比小于25∶1 mL/g，黃酮提取得率隨著液料比增大而升高，這是因為當提取溶劑的體積增加，花生殼粉末在提取溶劑中的分散程度亦增大；同時提取溶劑與細胞內(nèi)中的黃酮濃度差增大。當液料比大于25∶1 mL/g，黃酮提取得率增加不明顯，這是因為液料比已不是影響黃酮提取得率的主要因素，繼續(xù)增大液料比會加大能耗也會導(dǎo)致溶出更多的雜質(zhì)[18]，因此在后續(xù)的單因素實驗中，將液料比定為25∶1 mL/g。

2.1.3 提取溫度對黃酮提取得率的影響

固定花生殼粉末20.00 g、提取溶劑pH 12.0、液料比25∶1 mL/g、提取時間5 min和酸沉pH 4.0，探討提取溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃時，對黃酮提取得率的影響。

由圖1可知，當提取溫度小于70 ℃，黃酮提取得率隨著提取溫度升高而增大，這是因為當提取溫度上升，分子熱運動速率加大[19]，使細胞壁結(jié)構(gòu)遭受破壞的程度增加，同時提取溶劑溶解黃酮的能力增強。當提取溫度大于70 ℃，黃酮提取得率隨著提取溫度升高而變化不明顯，繼續(xù)升高提取溫度，可能會損壞黃酮的生物活性，因此在后續(xù)的單因素實驗中，將提取溫度定為70 ℃。

2.1.4 酸沉pH對黃酮提取得率的影響

固定花生殼粉末20.00 g、提取溶劑pH 12.0、液料比25∶1 mL/g、提取溫度70 ℃和提取時間5 min，探討酸沉pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0時，對黃酮提取得率的影響。

由圖1可知，當酸沉pH小于3.5，黃酮提取得率隨著酸沉pH增大而增大，這是因為黃酮母核中吡喃環(huán)上的氧原子具有一定堿性，易形成佯鹽而溶解在浸出液中，使部分黃酮沒有沉淀析出。當酸沉pH大于3.5，黃酮提取得率隨著酸沉pH增大而降低。這是因為多數(shù)黃酮分子中具有酚羥基，顯弱酸性，當酸沉pH越小，黃酮越容易形成沉淀從浸出液中沉淀析出。因此在后續(xù)的單因素實驗中，將酸沉pH定為3.5。

2.1.5 提取時間對黃酮提取得率的影響

固定花生殼粉末20.00 g、提取溶劑pH12.0、液料比25∶1 mL/g、提取溫度70 ℃和酸沉pH 3.5，探討提取時間分別為5、8、11、14、17、20 min時，對黃酮提取得率的影響。

由圖1可知，當提取時間小于17 min，黃酮提取得率隨著提取時間延長而升高，這是因為當提取時間延長，從細胞內(nèi)擴散至提取溶劑的黃酮逐漸增多，當提取時間大于17 min，黃酮提取得率增加不明顯，這可能是因為兩相中的黃酮濃度已接近平衡。繼續(xù)延長提取時間可能會使黃酮發(fā)生降解或順反異構(gòu)化[15]。

2.2 正交實驗結(jié)果與分析

2.2.1 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以黃酮提取得率為評價指標，利用正交設(shè)計助手ⅡV3.1對提取溶劑pH、液料比、提取溫度、酸沉pH和提取時間這5個參數(shù)進行優(yōu)化。實驗因素及水平如表1所示，實驗結(jié)果如表2所示。

表1 正交實驗因素及水平表

表2 正交實驗結(jié)果

由表2中的極差R值可知，對花生殼黃酮提取得率的影響大小依次為：提取溫度>提取溶劑pH>酸沉pH>提取時間>液料比。

2.2.2 方差分析與驗證實驗

對表2中的數(shù)據(jù)進行方差分析，得到的結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析表

由表3可知，提取溶劑pH、液料比、酸沉pH和提取時間這4個因素均不顯著，提取溫度這個因素顯著。

由表2中的均值1、均值2、均值3和均值4可知，提取工藝的最佳條件是：A2B4C4D4E3，即提取溶劑pH 12.0、液料比30∶1 mL/g、提取溫度80 ℃、酸沉pH 4.0、提取時間17 min。因表2中的16組實驗沒有A2B4C4D4E3這個組合，所以應(yīng)進行驗證實驗：取花生殼原料20.00 g，在A2B4C4D4E3條件下，進行8組平行實驗，發(fā)現(xiàn)黃酮提取得率(1.113±0.010)%，黃酮純度(16.90±0.13)%。這表明，優(yōu)化后的微波輔助堿液提取花生殼黃酮工藝穩(wěn)定、可靠。

3 結(jié)論

花生殼廉價易得，以花生殼為原料提取黃酮，節(jié)省資金且環(huán)保。利用微波作輔助技術(shù)，與傳統(tǒng)的直接加熱技術(shù)和酶輔助相比，具有提取時間短等優(yōu)點[3]；與超聲波輔助相比，具有噪聲小等優(yōu)點[3,20]；與高壓脈沖電場輔助相比，設(shè)備成本低[15]；與協(xié)同輔助相比，操作簡單[3]。采用氫氧化鈉水溶液當提取溶劑，方便使用酸沉技術(shù)，將花生殼黃酮從浸出液中沉淀析出。酸沉這一步驟可減輕后續(xù)分離純化的負擔，且在酸沉之后過濾得到的濾液，經(jīng)過調(diào)pH等步驟，可當作花生殼黃酮的提取溶劑，從而實現(xiàn)試劑的循環(huán)利用；若以乙醇水溶液為提取溶劑，在乙醇回收過程中需旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，從而增加功耗和成本。

本研究以湖南省長沙市近郊的花生殼為原料，結(jié)合微波輔助技術(shù)和堿提酸沉技術(shù)開展黃酮提取工藝，利用單因素和正交實驗優(yōu)化工藝參數(shù)。發(fā)現(xiàn)最優(yōu)提取條件：提取溶劑pH 12.0、液料比30∶1 mL/g、提取溫度80 ℃、酸沉pH 4.0、提取時間17 min。在此條件下，黃酮提取得率(1.113±0.010)%，黃酮純度(16.90±0.13)%。