氯霉素、孔雀石綠快速檢測淺析與應用

楊雪婷，李志軍，和永梅

（云南省迪慶藏族自治州維西傈僳族自治縣農業農村局畜牧獸醫水產服務中心 674600）

1 前言

快速檢測的應用與發展一直深受檢疫有關部門和市場監管部門的關注，便捷、快速、高效也成為各種檢測試劑盒改進發展的目標。 目前維西縣市場上的動物產品，特別是水生動物產品草魚、鯉魚、鯽魚、蝦、泥鰍等都需要得到及時準確地檢驗，人們對食品安全越來越重視， 更需要在一定程度上減少帶疫病動物產品或動物體內有害殘留成分對人們生活的影響。 在水產品市場上， 盡管監管機構對檢測水產品中的孔雀石綠和氯霉素等有害藥物殘留有嚴格要求。 但市場監管部門、農業部門對水產的檢測監管機制還有待完善，在短期利益的驅使下，水產行業仍然存在非法使用氯霉素和孔雀石綠的現象， 特別在非洲豬瘟疫情在國內發生以來，水產、禽類、牛羊等肉類占據的市場份額也在不斷增加， 水產品的安全性也已成為影響食品質量安全和國際市場競爭力的重要因素。 重視食品安全也關系到人類健康。 因此，在水產市場檢測監管過程中， 應該了解快速檢測， 進行市場預防、檢測和控制，才能快速、準確地獲得結果，并維護市場食品安全。

1.1 孔雀石綠和氯霉素簡介

氯霉素主要是對人和動物進行細菌感染性疾病治療的抗生素，用于治療的同時還產生毒副作用,對機體的免疫系統、血液循環系統健康造成威脅[3]，影響紅細胞、白細胞等血細胞在血液中的動態平衡，導致粒狀白細胞缺乏癥,抑制紅髓造血[2]。 使用該藥物后在動物體內的代謝殘留還會增強病菌的耐藥性,對動物產品安全和人類食品健康甚至生物圈的生態平衡產生嚴重影響。目前，美國、歐盟、中國等國家和組織都對動物性食品中氯霉素極其代謝的有害殘留量有著明確的限定， 不得在有關產品中檢測出[4]。 雖明令禁止，但就目前來看，人們在養殖中對使用氯霉素治療的依賴還難以完全擺脫，藥物監管不到位，使出售到市場上的水生動物產品體內依然存在氯霉素過量殘留。

孔雀石綠自身三苯甲烷類結構與它特有的毒性密不可分。因其良好的殺菌效果而被用于水產養殖。 當水生動物體從周邊環境中攝入孔雀石綠， 經機體內發生生物轉化代謝后主要以無色孔雀石綠的形式蓄積在水生動物的器官組織中， 整個代謝過程中在排泄組織中濃度最高[8]。 科學研究發現，使用孔雀石綠后水生動物體內易留存其代謝產物， 被人攝入吸收后能透過細胞膜，在細胞代謝過程中進入細胞核，對DNA 的雙螺旋結構產生影響，誘發正常細胞癌變[6]。 無色孔雀石綠是孔雀石綠在環境中代謝的主要產物，容易在水生動物產品中孔雀石綠代謝產物殘留。無色孔雀石綠使機體各項生化指標發生變化的毒性作用遠遠高于母體化合物，殘留量更多，殘留時間較更長，殘留問題更應得到重視。

1.2 快速檢測方法的研究現狀

在氯霉素殘留控制過程中，準確、便捷、快速的檢測方式發揮了關鍵的作用。 近年來，氯霉素的檢測方法得到了人們的積極探索。 從最初利用微生物進行定性檢測，到如今各種先進檢測技術，如酶聯免疫法[3]、高效液相色譜法[9]、氣相色譜法[9]等,不停地推動著食品安全監督管理事業的完善與發展。 讓氯霉素的檢測靈敏度、精確性、檢測時限等方面的技術在以往的基礎上都得到了有力提升，使氯霉素的檢測極限，精密度和回收率大大提高。 膠體金免疫層析試紙條,應用免疫學競爭方法,在膠體金結合墊上使抗氯霉素單克隆抗體-膠體金復合物包被覆蓋, 同時在硝酸纖維素薄膜表面包被氯霉素抗原作為檢測線[7]。 當待檢物中氯霉素殘留達到一定限度， 就能夠競爭結合膠體金標記的氯霉素單克隆抗體,能通過直觀的顏色反映檢測的結果[7]。適用于市場氯霉素殘留檢疫現場監控。

目前在無色孔雀石綠殘留控制過程中，準確、快速的檢測方式也發揮了關鍵的作用， 檢測方法在快速的科學技術發展過程中日新月異。 主要有薄層色譜法[6]、分光光度法[6]等。 這些方法以定量檢測殘留為目標，需要大量的專業的技術人員投入，需要價格昂貴的儀器設備支持，操作要求精細，過程復雜。 在現場進行大規模的檢測，要求操作簡易便捷，反映靈敏，儀器、試劑盒實用價廉，用時短。 快速檢測方法以免疫學方法為基礎，在研究人員的大量研究、實驗中均有良好的反應性，適合作為藥物殘留檢測的快速篩選方法之一[5]。 若設立市場快速檢測監控站，作為一種僅需通用儀器的快速靈敏的檢測技術， 酶聯免疫檢測試劑盒可用于現場檢測無色孔雀石綠中的藥物殘留。

1.3 實驗目的和意義

快速檢測手段的應用與發展一直深受檢疫有關部門和市場監管部門的關注，便捷、快速、高效也成為各種檢測試劑盒改進發展的目標。 良好的市場監管為人們的飲食健康安全提供了保障,同時為我國的食品對外貿易發揮了巨大作用。 為了保證各種水生動物產品的質量安全，能夠在最短的時間內建立便捷、高效的快速檢測技術來檢測水產品中無色孔雀石綠與氯霉素的殘留具有重要的意義。 用一種方便快速的檢測手段，既保證了效率，又節省了人力，及時發現“問題產品”及時處理，也避免了對人們生活造成不必要的影響和傷害。

2 實驗所需材料與原理淺析

2.1 實驗儀器及試劑

電子秤、移液槍、均質器、振蕩器、離心機、氮吹儀、孔雀石綠快速檢測試劑盒、氯霉素快速檢測試劑盒。 氯霉素快速檢測試劑盒中包括：緩沖液、提取劑、凈化劑、離心管（15mL 和5mL）、氯霉素快速檢測卡。孔雀石綠快速檢測試劑盒中包括：提取劑A、提取劑B、緩沖液、氧化劑、凈化劑、離心管（15mL 和5mL）、孔雀石綠快速檢測卡。

2.2 快速檢測氯霉素的實驗原理

氯霉素快速檢測卡對水生動物組織中的氯霉素殘留檢出限為0.3ppb， 應用了競爭抑制免疫層析的原理使樣本液中的氯霉素在與檢測卡接觸過程中通過競爭抑制了抗體和NG 膜檢測線（T）上氯霉素蛋白偶連物的結合[7]。 在樣本處理過程中，選用乙酸乙酯[1]作提取劑，提取出肌肉內臟中的氯霉素，混勻離心后氯霉素溶于上層有機相，將有機相吹干，選用正己烷做凈化劑[1]，除去其中脂質分子，最后用試紙進行檢測。

2.3 快速檢測孔雀石綠的實驗原理

孔雀石綠快速檢測卡對魚、 蝦等組織中的孔雀石綠檢出限為2ppb， 應用了競爭抑制免疫層析的原理使樣本液中的孔雀石綠在與檢測卡接觸過程中，通過競爭性抑制抗體和NG 膜檢測線上孔雀石綠蛋白偶連物的結合[5]。 在樣本處理過程中，選用乙腈作提取劑A、中性氧化鋁作提取劑B[8]盡可能有效地充分提取組織中的孔雀石綠代謝產物， 混勻離心后孔雀石綠代謝產物溶于上層有機相加入微量氧化劑，選用正己烷做凈化劑，提取的成分溶于下層溶液并呈紫紅色，用氮氣吹干后，加緩沖液混勻待檢。

2.4 快速檢測結果判定

注：圖中C 線為質控線，T 線為檢測線。 當測試結果中C 線顯色比T 線顯色淺或與T 線顯色相同時檢測結果為陰性；當C 線顯色比T 線顯色深或C 線顯色T 線不顯色時檢測結果為陽性；當C、T 線均不顯色或只有T 線顯色時檢測結果無效。

3 市場監管和快速測試應用的前景

快速檢測方法基于免疫學方法， 并采用競爭抑制免疫層析原理。 選擇基于此技術的快速檢測套件來進行市場監管的快速檢測，并在市場食品衛生監管中做得更好，要容易得多。 此類產品應價格便宜，靈敏，快速，適合大規模現場檢測，適合作為藥物殘留檢測的快速篩選方法， 并且只需要使用普通儀器的檢測技術即可進行無色孔雀石綠現場藥物殘留檢測初步篩選測試，實驗結果高度可靠。 如果發現陽性樣品，樣品將被送至上級實驗室進行重新檢查，等待結果，然后將采取相應的措施以積極應對。

快速檢測卡為定性檢測，整個檢測過程只需要90min 左右，適用于現場監控和大量樣品篩查。 操作簡單，對儀器設備要求不高。 為了保證各種水生動物產品的質量安全，需要能夠在最短的時間內建立便捷、 高效的快速檢測技術來檢測水產品中無色孔雀石綠與氯霉素的殘留。 盡管快速檢測手段具有快速、便捷等諸多優點，但面對定量檢測等要求，其自身缺陷就顯現出來，因為我們得到的只是知道魚體內是否含有違禁藥物， 具體藥物殘留有多少，沒有定量，這是快速檢測的弊端。 從基層市場監管來看，快速檢測卡能夠更快，更準確地做好食品安全檢測，能夠為監管部門從市場中把關起到良好的輔助作用， 逐漸對養殖業產生良好的促進作用。 隨著科學技術的發展，會有更多先進的檢驗技術問世，借助這些先進的技術，有關部門就能更好地服務于市場，服務于人們。