急性ST 段抬高型心肌梗死患者血漿微小核糖核酸-208a 水平對并發急性心力衰竭的預測價值

楊朋康 董昕

急性心力衰竭(acute heart failure，AHF)是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者最常見的院內并發癥之一，一旦發生，往往提示患者預后欠佳，嚴重者可導致患者休克或死亡[1-2]。 早期預測AHF，及時采取針對性干預措施，對改善AMI患者預后具有重要臨床意義。 微小RNA(micro RNA，miRNA)是真核生物體內廣泛存在的一類長約22nt 的非編碼小RNA。 近年來，大量研究證據顯示多種miRNAs 可能參與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病的發生發展過程[3-6]。MiR-208a 即是其中之一，正常人血清中幾乎檢測不到miR-208a 表達，但在AMI 患者血清中表達顯著增加，部分研究甚至認為miR-208a 對AMI 的早期診斷價值高于心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)等傳統血清學指標[7-8]。 此外，有研究發現miR-208a 可通過上調肌球蛋白重鏈β(myosin heavy chain beta，β-MHC)，誘發心肌重構，參與心肌纖維化，是預測心源性死亡和心力衰竭的重要因子[9]。本研究擬通過檢測急性STEMI 患者血漿miR-208a表達水平情況，觀察血漿miR-208a 對急性ST 段抬高型心肌梗死(ST-elevated myocardial infarction，STEMI)患者并發AHF 的預測價值，為臨床提供參考。

資料與方法

1.研究對象 連續性選擇2018 年1 月至2019年6 月，在西安市第一醫院心內科住院治療的急性STEMI 患者152 例納入病例組，包括男性85 例，女性67 例，平均年齡(60.97±12.40)歲。 納入標準:①年齡＞18 歲；②首次發病，且發病到入院時間＜12 h；③STEMI 診斷符合2015 年中國急性ST 段抬高型心肌梗死診斷和治療指南[10]，且均經冠狀動脈造影證實。 排除標準:①既往診斷冠心病、心肌病、瓣膜病、結締組織病、心力衰竭等各類心臟疾病；②合并嚴重肝腎功能障礙、各類惡性腫瘤、嚴重感染、自身免疫性疾病、血液系統疾病、嚴重腦卒中等；③妊娠期女性。 另采用隨機數字表法在同期于我院行健康體檢人員中隨機選擇60 例作為對照組，其中男性33 例，女性27 例，平均年齡(59.85±12.28)歲。 經西安市第一醫院倫理委員會審核批準，所有入組人員充分了解研究內容，并簽署知情同意書。

病例組患者入院后48 h 內根據其臨床表現、體格檢查和相關輔助檢查結果評估是否合并AHF，將病例組分為AHF 亞組和非AHF 亞組。 評估標準參考文獻[11]:①新發的典型心力衰竭臨床表現(如疲乏、呼吸困難、不能平臥等)；②心率加快，或出現奔馬律，或下1/2 肺野可聞及濕羅音(住院期間心功能Killip II 級或以上)；③胸部影像學檢查顯示存在肺淤血、肺水腫、胸腔積液；④超聲心動檢查提示心功能受損(如LVEF＜0.5 等)；⑤心源性休克。

2.方法 (1) 臨床資料收集:收集所有入組人員的一般臨床資料，包括性別、年齡、BMI、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、血脂異常病史及再灌注治療情況，動態檢測BNP、hs-CRP)和cTnI，均取入院24 h 內的峰值作為結果進行統計。

(2) 血漿miR-208a 檢測:病例組患者在入院時采集外周靜脈血，對照組采集清晨空腹靜脈血，1 600 r/min，離心15 min 后使用含EDTA 的離心管留取上清液，再4 ℃條件下15 000 r/min，離心15 min，使用無RNA 酶的凍存管收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存備用。 采用普洛麥格(北京)生物技術有限公司的EastepTM總RNA 提取試劑盒提取總RNA，采用實時熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測血漿miR-208a 水平，以U6 為內參基因，試劑盒采用Takara 公司的Mir-XTM miRNA qRT—PCR SYBR?試劑盒，miR-208a 特異引物為5′-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3′，嚴格按照使用說明書進行。采用2-△△Ct方法計算miR-208a 相對表達水平。

3.統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件分析處理。 對符合正態分布和方差齊性檢驗的計量資料結果以均值±標準差表示，兩組均數比較用t 檢驗；對于不符合正態分布或方差齊性檢驗的計量資料結果采用四分位數表示，兩組樣本比較采用Mann-Whithey 檢驗。 計數資料結果以構成百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。 相關性分析采用Pearson 線性相關性分析法。 繪制ROC 曲線評價miR208a 和BNP 對AHF 的預測價值，曲線下面積(area undercurve，AUC)比較采用單因素Z 檢驗。 多因素分析采用二分類Logisitic 回歸分析法。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

表1 病例組和對照組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較[，n(%)，M(QR)]

項目 對照組(n ＝60) 病例組(n ＝152) t/χ2/Z 值 P 值年齡/歲 59.85±12.28 60.97±12.40 0.594 0.560男性 33(55.0) 85(55.9) 0.015 0.903 BMI/(kg/m2) 25.12±4.23 25.39±3.95 0.439 0.666吸煙 24(40.0) 63(41.5) 0.037 0.847高血壓 36(60.0) 99(65.1) 0.490 0.484糖尿病 10(16.2) 20(13.2) 0.436 0.509血脂異常 35(58.3) 104(68.4) 1.939 0.164再灌注治療 — 137(90.1) — —BNP/(ng/L) 172.80(85.20，261.10) 1345.70(945.60，1945.50) 10.608 0.000 Hs-CRP/(mg/L) 4.80(2.50，8.10) 10.50(7.90，13.60) 8.885 0.000 cTnI/(μg/L) 0.53(0.40，0.66) 2.82(1.81，6.17) 8.557 0.000 miR-208a 1.33(1.00，1.67) 26.67(16.00，42.67) 10.919 0.000

表2 AHF 亞組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較[，n(%)，M(QR)]

表2 AHF 亞組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較[，n(%)，M(QR)]

項目 AHF 亞組(n＝86) 非AHF 亞組(n＝66) t/χ2/Z 值 P 值年齡/歲 61.32±11.94 60.50±13.06 0.402 0.692男性 53(61.6) 32(48.5) 2.617 0.106 BMI/(kg/m2) 25.54±4.06 25.18±3.83 0.555 0.586吸煙 39(45.4) 24(36.4) 1.242 0.265高血壓 57(66.3) 42(63.6) 0.115 0.735糖尿病 13(15.1) 7(10.6) 0.665 0.415血脂異常 64(74.4) 40(60.6) 3.297 0.069再灌注治療 73(84.9) 63(95.5) 4.430 0.035 BNP/(ng/L) 1668.20(1056.40，3345.30) 990.80(458.20，1133.60) 6.937 0.000 Hs-CRP/(mg/L) 12.30(8.60，15.30) 9.60(5.70，11.70) 6.606 0.000 cTnI/(μg/L) 4.80(2.84，8.03) 1.62(1.05，3.98) 9.438 0.000 miR-208a 42.67(32.00，64.00) 21.33(13.33，42.67) 9.573 0.000

結 果

1.兩組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較 病例組與對照組比較在年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常等方面，差異無統計學意義(均P＞0.05)；病例組BNP、hs-CRP、cTnI 血清水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義(均P ＜0.05)。 病例組血漿miR-208a 相對表達水平顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P ＝0.000，表1)。

2.AHF 亞組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較 AHF 亞組與非AHF 亞組比較，兩組在年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常等方面兩組差異無統計學意義(均P＞0.05)；AHF 亞組再灌注治療比例明顯低于非AHF 亞組，BNP、hsCRP和cTnI 血清水平均顯著高于非AHF 亞組，差異具有統計學意義(均P＜0.05)。 AHF 亞組血漿miR-208a 相對表達水平顯著高于非AHF 亞組，差異均具有統計學意義(P ＝0.000，表2)。

3.病例組血漿miR-208a 相對表達水平與BNP、hsCRP 和cTnI 的相關性分析 Pearson 相關性分析結果顯示病例組患者血漿miR-208a 相對表達水平與BNP、hsCRP 和cTnI 均呈正相關關系(均P ＜0.001， 表3)。

表3 影響血漿miR-208a 相對表達水平的相關性分析

4.急性STEMI 患者并發AHF 的危險因素分析以單因素分析P＜0.05 參數為自變量，包括再灌注治療、BNP、hs-CRP、cTnI 和miR208a，以是否并發AHF 為因變量，采用二分類Logistic 回歸分析結果顯示血漿miR-208a 相對表達水平是急性STEMI 患者并發AHF 的獨立危險因素(OR ＝2.118，95%CI:1.127～3.982，P ＝0.007， 表4)。

5.急性STEMI 并發AHF 的預測價值分析 繪制血漿miR-208a 和BNP 預測AHF 的ROC 曲線，AUC 分別為0.896(0.844，0.948)和0.879(0.827，0.932)，采用Z 檢驗比較兩者AUC 差異無統計學意義(P＞0.05)。 按照約登指數最大原則，血漿miR-208a 預測AHF 的cut-off 值為32.00，對應的敏感性和特異性分別為88.4%和83.3%(圖1)。

表4 影響急性STEMI 患者并發AHF 的Logistic 回歸分析結果

圖1 預測并發AHF 的ROC 曲線

討 論

盡早識別AMI 后AHF 發生，指導臨床醫生及時進行干預，是改善此類患者預后的關鍵。 目前研究已發現BNP、hs-CRP、胱抑素C、甲狀腺激素等多種血清學標記物具有一定預測AHF 價值，但普遍存在特異性和(或)敏感性欠佳的問題[12-15]。 如BNP 作為目前臨床廣泛推薦的心力衰竭預測和評估指標，其對AHF的陰性預測值可到達94%～98%，但陽性預測值僅為60%[12]。 此外，BNP 生物半衰期時間僅為20 min，對檢測時間窗有一定限制。 因此，尋找其他可表達穩定，檢測方便，且預測AHF 特異性和敏感性俱佳的生物學標志物具有重要臨床意義。

MiRNAs 是一類廣泛存在于真核生物體內的非編碼小RNA，一般長約22nt。 大量研究證據證實miRNAs 在多種腫瘤疾病的發生發展進程中起到至關重要作用[16]。 近年來，越來越多研究發現miRNAs 與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭、高血壓、心肌肥大等心臟疾病的發生發展也密切相關[3-6]。 如miR-181、miR-126、miR-155 等可通過抑制/激活趨化因子參與動脈粥樣硬化形成過程[17]；外周血miR-499用于診斷AMI 的AUC 可達0.86，診斷敏感性和特異性均高于90%[18]；miR-106b-5p、miR27a-3p 和miR8b-5p 可能參與腎素-血管緊張素-醛固酮系統調節，與高血壓發病密切相關[19]。

MiR-208a 是目前心血管病領域關注較多的miRNAs 種類之一，幾乎僅在心臟中表達，在心肌損傷時表達升高。 多個動物及臨床研究表明，外周血中miR-208a 水平在心肌壞死后1 h 即可出現特異性升高，3 h 達到峰值[7，20]。 Xu 等[21]使用異丙腎上腺素誘導構建大鼠心肌缺血動物模型，并檢測大鼠心肌缺血后不同時段血漿miR-208a 與cTnI 水平，發現兩者在梗死后6 h 內變化趨勢相似，6 h 后miR-208a 呈下降趨勢，而cTnI 繼續升高。 Wang 等[8]研究發現miR-208a 對心肌梗死具有較高的診斷價值，ROC 曲線結果AUC 可高達0.965，且在心肌梗死發病4 h 內，部分患者外周血檢測肌鈣蛋白未達到診斷閾值時即能夠檢測到miR-208a 明顯升高。 Han等[22]研究發現AMI 患者血漿miR-208a 表達水平與心肌損傷程度密切相關。 此外，也有研究對miR-208a 診斷AMI 持否定意見，如D′Alessandra 等[23]檢測9 例ST 段抬高型心肌梗死患者miR-208a 血清表達水平，結果顯示其中6 例患者未檢測出miR-208a，另外3 例患者miR-208a 表達水平很低。 考慮AMI 患者血清miR-208a 檢測有一定時間窗，各研究結論不一致可能與之相關。 本研究結果顯示病例組患者血漿miR-208a 相對表達水平顯著高于健康對照組，且急性STEMI 患者血漿miR-208a 相對表達水平與外周血BNP、cTnI 和hs-CRP 均呈正相關關系，再次表明血漿miR-208a 表達水平可反應AMI患者即時心肌損傷狀態，可能對AHF 發生具有潛在的預測價值。

目前，研究證實miR-208a 是由α-心肌肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain，α-MHC)基因(Myh6)29 號內含子編碼，可上調β-心肌肌球蛋白重鏈(βmyosin heavy chain，β-MHC)[9]。 Callis 等[24]構建miR-208a 轉基因小鼠模型發現miR-208a 高表達能誘導肥厚心肌細胞中β-MHC 表達增加。 相反，敲除miR-208a 可導致成年小鼠β-MHC 表達減少[25]。眾所周知，心臟收縮功能取決于兩種肌球蛋白重鏈亞型α-MHC 和β-MHC 的比例，二者相對表達比例發生變化將導致心肌肥大和纖維化。 一般研究認為，β-MHC 表達增加是心肌肥厚和心衰的重要標志。 因此，對于AMI 患者并發AHF，除了與心肌梗死后即刻的心肌損傷有關，可能也與AMI 后心肌miR-208a 表達上調，β-MHC 表達增多有關。 本研究進一步比較AHF 亞組和非AHF 亞組血漿miR-208a表達水平，結果顯示AHF 亞組顯著高于非AHF 亞組，多因素Logistic 回歸分析結果顯示，血漿miR-208a 是急性STEMI 患者合并AHF 的危險因素。ROC 曲線分析結果顯示血漿miR-208a 預測AHF 的AUC 為0.896(95%CI:0.844～0.948)，與BNP 比較差異無統計學意義，cut-off 值對應的敏感性和特異性分別為88.4%和83.3%，表明血漿miR-208a 表達水平對AHF 具有較高的預測價值。

綜上所述，本研究發現急性STEMI 并發AHF患者血漿miR-208a 相對表達水平較無AHF 患者顯著升高，血漿miR-208a 可作為急性STEMI 患者并發AHF 的早期預測因子。 最后，本研究的不足之處在于:一方面，作為單中心研究，本研究納入樣本例數有限，研究結果可能與真實世界存在偏倚，期待后續多中心大樣本研究證據進一步驗證；另一方面，miR-208a 在AHF 發生進程中的具體生物學機制尚不明確，外周血miR-208a 表達水平增高僅是心肌細胞損傷后釋放到循環中，抑或是通過特殊信號通路導致的表達增加，仍需進一步繼續深入研究。