擴張型心肌病心肌纖維化與β-鏈蛋白表達相關性的初步分析

朱 慶 趙艷麗 韓麗媛 連國亮 卜雯婧 陳 東

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心腔(左心室和/或右心室)擴大、心肌收縮功能障礙為主要特征的一類有相似表現的心肌疾病，病因不一，且有的病因尚不明。 是導致心力衰竭的較常見疾病之一[1]。 DCM 除心肌細胞變性外，還常伴有心肌間質膠原異常增生和堆積。 膠原增生并將心肌細胞包繞分隔，嚴重損害DCM 的心臟功能。研究認為β-鏈蛋白(β-catenin)是Wnt 信號通路上的重要信號分子，且與纖維化有緊密關連[2]。 本研究擬通過病理形態觀察及免疫組化技術檢測DCM，探討β-catenin 蛋白表達與心肌纖維化的關系。

資料與方法

1.病理材料來源 病例選自首都醫科大學附屬北京安貞醫院2015 年至2018 年心臟移植獲得的臨床、超聲、病理診斷為擴張型心肌受體心臟(DCM組)和法醫尸檢獲取的正常心肌對照，各15 例。DCM 組心肌取自移植心臟左心室灰白區及灰紅區心壁，對照組心肌選自正常心臟左心室心肌，每例取6～10 塊組織。 研究通過首都醫科大學附屬北京安貞醫院倫理委員會批準。 DCM 組及對照組組織材料均用10%甲醛充分固定，常規技術樣品處理，石蠟包埋，制作成6 μm 切片，再經不同染色或免疫組化處理，供不同應用。

2.標本處理方法 (1) 蘇木素-伊紅染色(HE染色) 切片供觀察心肌的病理形態特征:并用3DHISTECH 切片掃描儀掃描記錄和觀察其病理形態特征。

(2)免疫組織化學染色(IHC)及免疫組化半定量檢測法研究心肌內β-catenin 蛋白的表達:將DCM組及對照組的切片，加200 μL 封閉液，在室溫下封閉1 h，加入200 μL 的一抗，4 ℃孵育過夜，滴加酶標二抗，在室溫下孵育30 min；經蘇木精復染后封片；用3DHISTECH 切片掃描儀掃描后觀察兩組心肌 內 β-catenin 蛋 白 的 表 達 情 況； 在 掃 描 儀CaseViewer 軟件內截取400×放大倍數下IHC 切片內DCM 組纖維化區、非纖維化區及對照組6 個不同區域的心肌β-catenin 蛋白表達，使用ImageJ 軟件測量β-catenin 蛋白區域的平均光密度(average optical density， AOD)＝積分光密度值(integrated density，IOD)/陽性面積(Area)代表該區域下β-catenin 蛋白表達強度，取AOD 的平均值代表該例標本不同區域的β-catenin 蛋白表達強度。

(3)用Masson 染色顯示心肌纖維化的程度:將DCM 組及對照組石蠟標本的石蠟切片，

用Weigert 蘇木素染5 ～10 min，麗春紅酸性品紅溶液染5～10 min，磷鉬酸溶液處理約5 min，苯胺藍染液復染3 min，1%冰醋酸水溶液沖洗，脫水、透明、封片；用3DHISTECH 切片掃描儀掃描后觀察兩組心肌纖維化情況；在掃描儀CaseViewer 軟件內截取200×放大倍數下隨機選取Masson 染色切片內實驗組纖維化區、非纖維化區及對照組各20 個心肌區域(除去心內膜、心外膜區)，用ImageJ 軟件測量纖維化區域面積S1/心肌區域面積S2 的比值代表該區域的纖維化程度，取比值的中位數代表該例心肌標本的纖維化程度[3]。

3.統計學方法 使用SPSS21.0 進行統計學分析。 計量資料以均數±標準差表示；采用單因素方差分析分析，兩兩比較采用LSD 法；用配對樣本t 檢驗比較DCM 組纖維化區與非纖維化區兩組間βcatenin 蛋白表達及纖維化程度差異；用獨立樣本t檢驗比較實驗組與對照組β-catenin 蛋白表達及纖維化程度的兩兩差異；β-catenin 及心肌纖維化程度的相關性采用Pearson 相關性分析，相關系數為0.8～1.0 極強相關，0.6～0.8 強相關，0.4 ～0.6 中等程度相關，0.2～0.4 弱相關，零～0.2 極弱相關或無相關。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.兩種心肌的病理形態學分析及β-catenin 蛋白免疫組化染色分析 HE 染色及Masson 染色的組織病理形態見DCM 組心肌細胞對比正常組心肌細胞表現為心肌細胞體積增大、外形伸長，核增大，核深染，核膜出現溝裂、迂曲或皺褶，心肌細胞間質纖維化，纖維化區心肌細胞可見空泡及玻璃樣變性伴心肌細胞萎縮，活動期纖維化區成纖維細胞及間質小血管增生，可見散在個別慢性炎癥細胞浸潤；靜止期纖維化區成纖維細胞減少，被大量纖維替代，周圍可見萎縮的心肌(圖1～2)；其中1 例纖維化區域周圍伴大量淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤(圖3)。DCM 心肌纖維化病例的纖維化區分布不均勻，部分以近心外膜和心內膜處較密集，部分發生于心壁內的纖維化主要沿間質血管分布，并以血管為中心向周圍穿插排列(圖4～5)。

圖1 DCM 心肌細胞肥大，核增大，纖維化由血管周圍開始向鄰近心肌細胞間伸展，活動期纖維化周圍心肌變性、萎縮，成纖維細胞增生(綠色箭頭)，散在淋巴細胞浸潤(紅色箭頭)(HE 染色)；圖2 對照組正常心肌細胞及血管周圍無明顯纖維化(HE染色)；圖3 DCM 纖維化區域內可見較多慢性炎癥細胞浸潤(HE 染色)；圖4 DCM 心內膜、心外膜及血管周纖維化(Masson 染色)；圖5 正常組心肌間質無大片纖維化(Masson 染色)；圖6 活動期纖維化區成纖維細胞表達β-catenin 蛋白(綠色箭頭)，周圍退變心肌內β-catenin 蛋白在細胞質內彌漫表達(紅色箭頭)(IHC 染色)；圖7 靜止期纖維化區成纖維細胞內β-catenin 蛋白表達減少或不表達(紅色箭頭)，周圍心肌胞質內β-catenin 蛋白表達減少，局灶可出現蛋白聚集(綠色箭頭)(IHC 染色)；圖8 非纖維化區域心肌閏盤β-catenin 可表達升高，胞質內蛋白顆粒狀表達(紅色箭頭)(IHC 染色)；圖9 對照組正常心肌內僅有部分β-catenin 蛋白在閏盤弱表達(IHC 染色)

β-catenin 在心臟中表達于心肌細胞閏盤、血管內皮細胞、成纖維細胞。 β-catenin 在DCM 中間質纖維不表達，纖維化周圍區心肌細胞閏盤β-catenin表達升高，呈不規則塊狀染色，DCM 組13 例纖維化較重區域的周圍心肌內β-catenin 蛋白有較密集表達；在活動期纖維化區，可見成纖維細胞表達βcatenin 蛋白，周圍退變心肌內β-catenin 蛋白在心肌細胞質內彌漫表達(圖6)；靜止期纖維化區成纖維細胞內β-catenin 蛋白表達減少或不表達，周圍心肌胞質內蛋白表達減少(圖7)；非纖維化區域心肌閏盤β-catenin 可表達升高，呈粗線狀染色，部分也可呈塊狀但不常見(圖8)。 在DCM 組中，β-catenin 除在閏盤處表達外，在細胞質中也可出現顆粒狀表達、染色加深并沿肌絲分布于心肌細胞核兩側的細胞質內；而正常組內心肌細胞閏盤β-catenin 蛋白呈線狀染色，僅5 例出現β-catenin 蛋白集聚，而細胞胞質內未出現蛋白顆粒(圖9)。

2.免疫組織化學法及特殊染色法檢測β-catenin蛋白表達情況及心肌纖維化情況

(1) DCM 組纖維化區、非纖維化區與對照組βcatenin 蛋白表達的AOD 比較DCM 組纖維化區、非纖維化區與對照組β-catenin 蛋白表達的AOD 總體，差異有統計學意義(P ＝0.01)； DCM 組纖維化區與對照組心肌β-catenin 蛋白表達AOD 差異有統計學意義(t ＝3.047，P ＝0.009)，DCM 組非纖維化區與對照組心肌β-catenin 蛋白AOD 表達也差異有統計學意義(t ＝2.626，P ＝0.014)，DCM 組纖維化區與非纖維化區蛋白表達AOD 差異無統計學意義(t＝1.372，P ＝0.192， 表1)。

圖10 A:組心肌纖維化區β-catenin 與心肌纖維化程度的相關性；B:DCM 組心肌非纖維化區β-catenin 與心肌纖維化程度的相關性；C:對照組β-catenin 與心肌纖維化程度的相關性

表1 三組β-catenin 及纖維化程度S1/S2 比較ˉ

表1 三組β-catenin 及纖維化程度S1/S2 比較ˉ

組別 β-catenin AOD S1/S2 DCM 組纖維化區(n＝15) 0.59±0.13 0.57±0.07 DCM 組非纖維化區(n ＝15) 0.56±0.11 0.26±0.08對照組(n ＝15) 0.47±0.09 0.30±0.05 F 值 5.17 91.33 P 值 0.01 ＜0.001

3.DCM 組纖維化區組織、非纖維化區與對照組纖維化區域面積S1/心肌區域面積S2 比值的比較

DCM 組纖維化區、非纖維化區與對照組S1/S2 值差異有統計學意義(P＜0.001)； DCM 組纖維化區與非纖維化區S1/S2 值差異有統計學意義(t ＝10.124，P＜0.001)；DCM 組纖維化區與對照組S1/S2 值差異有統計學意義(t ＝12.051，P＜0.001)；但DCM 組非纖維化區與對照組S1/S2 值差異無統計學意義(t＝-1.455，P ＝0.157，表1)。

4.β-catenin 蛋白在DCM 組與對照組心肌中與心肌纖維化的相關性分析 DCM 組纖維化區βcatenin 蛋白AOD 與心肌纖維化區纖維化程度(S1/S2)呈明顯正相關(r ＝0.681，P ＝0.005)；DCM 組非纖維化區β-catenin 蛋白AOD 與心肌非纖維化區纖維化 程 度(S1/S2) 無 相 關 性(r ＝- 0.501，P ＝0.057)；對照組纖維化區β-catenin 蛋白AOD 與心肌纖維化程度(S1/S2)無相關性(r ＝-0.023，P ＝0.935，圖10)。

討 論

心肌間質纖維化是DCM 心肌的主要特征之一，心肌細胞間及血管周圍纖維化，是DCM 的典型病理表現[4]。 本研究表明，DCM 非纖維化區與對照組的β-catenin 蛋白表達并無明顯統計學差異，表明DCM心肌纖維化主要圍繞血管呈局灶及片狀，而非整體心肌細胞間質均發生廣泛纖維化。 纖維化區周圍心肌可見心肌細胞變性、萎縮，纖維化區周圍可見散在的慢性炎癥細胞浸潤，可能與下面將要討論的βcatenin 的作用相關。 本實驗中DCM 纖維化需與限制性心肌病纖維化相鑒別，具有嗜酸細胞增多癥的限制性心肌病可出現心內膜心肌纖維化、L?ffer 心肌炎，而無嗜酸細胞增多癥的限制性心肌病可出現灶片狀或彌漫的纖維化，但心內膜無纖維化改變。

β-catenin 蛋白作為Wnt /β-catenin 信號通路的重要組成部分，在體內各器官的纖維化病變中均具有重要作用。 劉金娟等[5]發現， 硬皮病小鼠皮膚組織中β-Catenin 蛋白增加，認為Wnt/β-Catenin 通路影響皮膚的纖維化病變。 He 等[6]發現， 慢性腎損傷中Wnt /β-catenin 通路激活將導致β-catenin 累積并誘導下游靶基因表達。 反映了Wnt /β-catenin信號通路過度激活會促進腎間質纖維化。 Ge 等[7]研究發現，肝纖維化程度與β-catenin 表達水平呈正相關，沉默β-catenin 蛋白可抑制膠原分泌和肝星狀細胞增殖，介導細胞凋亡。 而在心臟的心肌纖維化中，β-catenin 及其所在的Wnt/β-catenin 通路亦起著重要的作用，心外膜細胞和心臟成纖維細胞也有Wnt 反應，Wnt1 在體外誘導β-catenin 依賴性心外膜上皮細胞-間充質轉化(EMT)，促進心臟成纖維細胞增殖[8]。

在各種心臟的纖維化病變中，β-catenin 蛋白通常表達升高并認為與心肌纖維化關系密切。 Roberts等[9]研究發現，與β-catenin 增多相關的AnkB 功能喪失的小鼠模型在10 周齡時出現顯著的結構異常，包括顯著的雙心室擴張，纖維化和射血分數減少。Lin 等[10]在心肌梗塞(MI)患者的心肌及相關動物模型中檢測到β-catenin 蛋白在瘢痕區間質內表達升高并濃縮。 在我們的實驗中，β-catenin 的表達于成纖維細胞內、血管內皮細胞、心肌的閏盤或附近；纖維化活動期成纖維細胞β-catenin 表達明顯稍強于纖維化靜止期，周圍退變心肌內β-catenin 蛋白在心肌細胞質內彌漫表達，DCM 心肌細胞內β-catenin蛋白普遍較正常組高，纖維化區與非纖維化區并無差異，表明DCM 的心肌纖維化與心肌梗塞(MI)成因不同，我們推測DCM 的病因多樣，為廣泛的非直接損傷，如遺傳、免疫、病毒感染等，不同于MI 由于缺血而導致的局部心肌損傷所致。

研究表明β-catenin 是細胞表面鈣粘蛋白蛋白復合物的亞基，可被多種致病因素激活。 Wnt /βcatenin 的持續活化與纖維化疾病的發病機制有關。Yu 等[11]研究表明，在許多由上皮間質轉化介導的纖維增生性疾病中，有β-catenin 核異位表達，Lin等[10]的動物及細胞實驗發現轉染心肌細胞豬巨細胞病毒(pCMV)-β-catenin 蛋白質粒過表達βcatenin 蛋白，轉錄因子在患有心源性高血壓的Wistar 大鼠中顯示核定位，轉染β-catenin 蛋白質粒以劑量依賴性方式誘導心肌細胞凋亡并降低存活途徑標志物的表達。 Haybar 等[12]研究發現，在缺血性心肌中，心臟損傷后Wnt /β-連環蛋白信號傳導至心外膜，使得Wnt1 表達增加，成纖維細胞和肌細胞擴增，導致心肌纖維化，Wnt5a 在心肌梗塞后誘導IL-6 并引起成纖維細胞和炎癥的相互作用。 我們也觀察到，DCM 患者纖維化區域內可以出現以淋巴細胞浸潤為主的炎癥性反應，但僅為個例，并非普遍，Kawai 等[13]研究證實，在動物模型中誘導小鼠心肌炎可發生擴張型心肌病。 我們觀察到β-catenin 在DCM 心肌細胞內普遍升高，而不在心肌間質纖維化區，其原因是否與纖維化的成因等不同有關? 纖維化與纖維疤痕的病理有差別? 還有待研究及探討。

在我們的研究中，觀察到的β-catenin 蛋白在心肌細胞胞漿內表達及閏盤處聚集是很有趣的現象之一，通過結合形態學比對觀察，纖維化區的一部分蛋白聚集表達可能和閏盤的變異相關，即β-catenin 蛋白表達隨閏盤的變異增多，范圍增寬；而在活動期纖維化區DCM 退變心肌胞漿中β-catenin 蛋白的顆粒狀表達及聚集則可能是纖維化的潛在基礎條件，目前研究[14-15]認為，一旦Wnt /β-catenin 通路被激活，β-catenin 就會穩定表達并轉移到細胞核中，在那里與T 細胞因子/淋巴增強子結合因子結合，刺激靶基因的轉錄，包括纖維化相關的基因表達。 βcatenin 在細胞質中積累并引起Wnt 靶基因的轉錄激活，缺乏Wnt 配體，β-catenin 被泛素化并被靶向蛋白酶體降解，Wnt 信號被抑制，而在沒有Wnt 刺激的情況下，細胞質β-連環蛋白水平通過降解復合物保持低水平，而我們觀察到活動期纖維化區散在的慢性炎癥細胞浸潤，間接印證了相關研究。 因此βcatenin 的表達部位的變化及凝集可能象征著相關纖維化基因的表達，而其通過何種方式轉移、纖維化與成纖維細胞、閏盤的關系也有待于進一步探索。

綜上所述，本材料表明β-catenin 蛋白表達主要在心臟的閏盤及近旁、成纖維細胞，其含量增多與DCM 患者心肌纖維化程度呈正相關，在β-catenin 蛋白增加的基礎上，β-catenin 蛋白的部位變化、炎癥刺激等因素可能是DCM 患者心肌纖維化的主要因素。本研究印證了部分相關動物及細胞實驗，并揭示了β-catenin 蛋白于DCM 與其他心臟病變中的類似及不同之處，探究了β-catenin 與心肌纖維化的關系，對于進一步的原因及相關分子通路機制還待進一步探索。