阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者Calpain-10 基因多態性與頸動脈內-中膜厚度的相關性分析

張維 張絨 徐家萍 廉秋芳 田慧娟 李晶晶 任朋朋 趙志茹

越來越多研究結果表明阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)是多種心腦血管疾病的危險因素，在OSAHS 人群中積極篩查心腦血管疾病的高危人群，早期予以干預治療對降低心腦血管病的發生率具有重要意義[1-3]。 Calpain-10 屬于鈣依賴性蛋白酶家族成員，近年來大量研究證實，Calpain-10 基因多態性與2 型糖尿病發生存在明顯遺傳相關性[4-5]。本課題組前期研究發現攜帶Calpain-10 基因SNP43 GG 基因型可顯著增加OSAHS 及缺血性卒中的發病風險[6]。 本次研究擬通過觀察OSAHS 患者Calpain-10 基因多態性與頸動脈內-中膜厚度(carotid intra - media thickness，CIMT)的關系，旨在進一步探討OSAHS 加速動脈粥樣硬化進程的作用機制，尋找防治心腦血管疾病潛在的遺傳學靶點。

資料與方法

1.研究對象 前瞻性連續選擇2017 年1 月至2019 年1 月，在延安大學咸陽醫院住院治療的OSAHS 患者納入研究記為OSAHS 組。 入組標準:①年齡＞18 歲；②OSAHS 診斷符合中華醫學會呼吸病學分會睡眠呼吸障礙學組《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南》[7]，且OSAHS 病程＞2 年；③臨床資料完整。 排除標準:①合并糖尿病；②合并其他嚴重肝腎疾病、惡性腫瘤等；③妊娠期女性。 本研究納入OSAHS 患者共260 例，包括男性169 例，女性91 例，平均年齡(58.01±8.69)歲，按照頸動脈超聲檢查結果分為兩個亞組，即CIMT 正常組和CIMT 增厚組，其中CIMT 正常組共84 例，包括男性58 例，女性26 例，平均年齡(57.84±9.10)歲；CIMT增厚組共176 例，包括男性111 例，女性65 例，平均年齡(58.09±8.49)歲。 另外，隨機選擇同期在我院體檢的126 例經頸動脈超聲檢查正常的健康體檢者作為對照組，其中包括男性76 例，女性50 例，平均年齡(57.82±8.26)歲。 本研究通過我院倫理委員會審核批準，所有入組成員均充分知情同意。

2.方法 (1)頸動脈超聲檢查:患者取仰臥位，應用Aplio 500 彩色多普勒超聲儀(日本東芝公司)檢測頸總動脈分叉處，及分叉處遠端和近端各1 ～1.5 cm 處的頸動脈內-中膜厚度(carotid intra -media thickness，CIMT)值，取左右兩側CIMT 最大值作分析用。 本研究定義CIMT＜1 mm 為CIMT 正常，CIMT≥1 mm 為CIMT 增厚。

(2)基因多態性檢測:①基因組DNA 提取:采集清晨空腹外周靜脈血3 mL，采用DNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全血基因組DNA。 ②PCR 擴 增: 上、 下 游 引 物(上 游: 5’-CACGCTTGCTGTGAAGTAATGC-3’:下游:5’-CTCTGATTCCCATGGTCTGTAG-3’)均由上海生工生物技術有限公司合成，嚴格按照PCR 操作流程進行擴增。 ③酶切:將擴增產物分別使用限制性內切酶NisⅠ進行酶切。 最后取酶切產物進行電泳，紫外燈下觀察并攝片。

(3)其他參數采集:收集所有入組患者相關臨床資料，主要包括患者性別、年齡、BMI，吸煙史，高血壓、冠心病、腦梗死等疾病史，以及入院時低通氣指數(apnea-hypopnea index，AHI)、HBA1c、TG、TC、LDL-C、HDL-C 等指標。

3.統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件分析處理。 正態分布計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t 檢驗，非正態分布資料采用中位數(M)及四分位數間距(P25，P75)表示，兩組間樣本比較采用Mann-Whitney U 檢驗。 計數資料以頻數(率)表示，組間比較采用χ2檢驗。 多因素分析采用二分類Logisitic 回歸分析法。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.各組一般臨床指標比較 對照組和OSAHS組比較，兩組在AHI、TC、LDL-C 和CIMT 等方面差異具有統計學意義(均P＜0.05)；其他因素，包括年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓、冠心病、腦梗死、TG、HbA1c 和HDL-C 等差異均無統計學意義(均P ＞0.05)。 CIMT 正常組和CIMT 增厚組比較，兩組在AHI、TC 和CIMT 等方面差異具有統計學意義(均P＜0.05)；其他因素，包括年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓、冠心病、腦梗死、HbA1c、FPG、TG、LDL-C 和HDL-C 等差異均無統計學意義(均P＞0.05，表1)。

2.基因分型及Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗結果 Calpain-10 基因SNP43 位點基因型包括純合野生型(GG 型)、雜合突變型(GA)及純合突變型(AA)三種基因型，本研究各組基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，具有良好群體代表性(均P＞0.05，圖1)。

3.各組Calpain-10 基因SNP43 位點基因型和等位基因分布比較 OSAHS 組與對照組比較，兩組Calpain-10 基因SNP43 位點位點基因型和等位基因分布頻率差異均具有統計學意義(χ2＝14.067，11.917，均P＜0.05)。 CIMT 正常組和CIMT 增厚組比較，兩組SNP43 位點基因型和等位基因分布頻率差異均具有統計學意義(χ2＝12.552，9.958，均P＜0.05，表2)。

表1 各組一般臨床指標比較[，n(%)，M(QR)]

表1 各組一般臨床指標比較[，n(%)，M(QR)]

注:與對照組相比，aP＜0.05；與CIMT 正常組相比，bP＜0.05

項目 對照組(n＝126) OSAHS 組(n＝260) OSAHS 組CIMT 正常組(n ＝84) CIMT 增厚組(n＝176)年齡/歲 57.82±8.26 58.01±8.69 57.84±9.10 58.09±8.49男性 76(60.3) 169(65.0) 58(69.1) 111(63.1)BMI/(kg/m2) 24.97±3.16 25.21±3.17 25.04±3.24 25.29±3.14吸煙 37(29.4) 96(36.9) 28(33.3) 68(38.6)高血壓 57(45.2) 132(50.8) 42(50.00) 90(51.1)冠心病 26(20.6) 64(24.6) 19(22.6) 45(25.6)腦梗死 19(15.1) 51(19.6) 14(16.7) 37(21.0)AHI 2(0，4) 30(25，38)a 27(21，33) 33(26，41)b HbA1c/% 5.43±1.32 5.48±1.42 5.47±1.55 5.49±1.37 TG/(mmol/L) 1.98±0.78 2.09±0.79 2.12±0.83 2.08±0.77 TC/(mmol/L) 4.13±0.88 4.49±0.92a 4.32±1.02 4.57±0.89b LDL-C/(mmol/L) 3.14±0.77 3.41±0.81a 3.40±0.87 3.40±0.87 HDL-C/(mg/L) 1.17±0.29 1.18±0.28 1.17±0.30 1.18±0.27 CIMT/mm 0.75±0.14 1.37±0.16a 0.80±0.15 1.65±0.17b

圖1 Calpain-10 基因SNP43 位點基因型分型

4.OSAHS 患者CIMT 的影響因素分析 ，以CIMT 為因變量，以年齡、性別及單因素分析P＜0.05的變量，包括AHI、TC 和SNP43 位點GG 基因型為自變量(表3)，采用二分類Logisitic 回歸分析法結果顯示SNP43 位點GG 基因型均是T2DM 患者CIMT 的 影 響 因 素(OR ＝1.786，95%CI:1.059 ～3.012，P ＝0.005)，見表4。

表2 各組Calpain-10 基因SNP43 位點基因型和等位基因分布比較[n(%)]

表3 自變量賦值

討 論

大量研究證據表明OSAHS 是缺血性卒中的危險因素，而且合并OSAHS 的缺血性卒中患者往往預后較差[8]。 既往研究認為OSAHS 導致心腦血管疾病的可能機制在于長期缺氧導致的夜間高血壓，血液粘稠度增加，腦血流動力學改變及腦血流量減少有關[1-3]。 此外，還有研究發現OSAHS 人群中2 型糖尿病患病率顯著增加，2 型糖尿病患者中OSAHS患病率亦明顯增加[9-10]，提示OSAHS 與2 型糖尿病可能互為危險因素，相互促進以加速動脈粥樣硬化進程。

表4 OSAHS 患者CIMT 的影響因素分析

Calpain-10 是一種半胱氨酸蛋白酶，屬于鈣依賴性蛋白酶家族成員，參與機體調節產熱、葡萄糖代謝及胰島素抵抗等過程。 近年來，國內外多項研究結果證實，Calpain-10 基因多態性與2 型糖尿病發病風 險 密 切 相 關[4-5，11]。 Horikawa 等[12]發 現 攜 帶Calpain-10 突變基因的人群2 型糖尿病患病風險增加了3 倍。 朱垚吉等[4]以中國人為研究對象共納入21 個研究的薈萃分析結果顯示Calpain-10 基因SNP43 位點突變與2 型糖尿病臨床易感密切相關。鑒于OSAHS 與2 型糖尿病之間的相互關系，本課題組推測Calpain-10 基因多態性也與OSAHS 密切相關，故比較260 例OSAHS 患者和126 例對照組人群Calpain-10 基因SNP43 位點基因型和等位基因的分布頻率，OSAHS 組人群GG 基因型和G 等位基因頻率顯著高于對照組，提示Calpain-10 基因同時作為2型糖尿病和OSAHS 的易感基因，可能與動脈粥樣硬化密切相關。

本課題組前期研究發現Calpain-10 基因SNP43位點多態性與缺血性卒中發生密切相關[6]。 然而，限于條件前期研究未對卒中患者進行病因學分型，Calpain-10 基因SNP43 位點突變如何參與缺血性卒中發病的具體機制尚不明確。 本次研究重點聚焦Calpain-10 基因多態性與CIMT 的相關性，嘗試探討Calpain-10 基因突變通過何種機制增加缺血性卒中風險。 結果顯示在OSAHS 人群中Calpain-10 基因SNP43 位點多態性與CIMT 增厚密切相關，攜帶SNP43 位點GG 基因型的OSAHS 患者發生CIMT 增厚的風險顯著增加，與前期研究結果及推測相互驗證，一定程度解釋了Calpain-10 基因多態性與缺血性卒中的相關性。

綜上所述，本研究發現Calpain-10 基因SNP43多態性與OSAHS 患者CIMT 增厚密切相關，攜帶GG 基因型OSAHS 患者CIMT 增厚的風險顯著增加。 然而，需要指出由于考慮動脈粥樣硬化為血管慢性改變過程，具有明顯時間依賴性，本研究納入OSAHS 患者均為病程超過2 年的患者，使本研究結果的適用性具有一定限制。 此外，前期研究已證實Calpain-10 基因SNP43 多態性與2 型糖尿病的關系，本研究為減小偏倚，納入的研究對象均明確排除合并糖尿病的患者，也使本研究結果適用具有一定限制。 最后，期待后續在更廣泛的人群中進一步探討Calpain-10 基因多態性與頸動脈硬化及缺血性卒中的相關性。