Cx43縫隙連接蛋白羧基末端磷酸化修飾對其功能的調控及其在腦缺血中的研究進展

左夏林 唐艷艷 李孔平 彭林輝 徐恩

廣州醫科大學神經科學研究所，廣州醫科大學附屬第二醫院神經內科（廣州 510260）

連接蛋白（connexin，Cx）構成的細胞間縫隙連接（gap junction，GJ），通過相鄰細胞之間的物質、能量交換及電、化學信號耦合，可以創建獨特的細胞信號傳導網絡，形成縫隙連接細胞間通訊（gap junction intercellular communication，GJIC）。GJIC在神經系統細胞生長、分化以及遷移等生理、病理過程中具有重要作用［1］。在人類連接蛋白家族的21個成員中，連接蛋白43（connexin 43，Cx43）是機體內分布最為廣泛，研究最為成熟的連接蛋白家族成員。Cx43合成于內質網核糖體，并在高爾基體內寡聚化，形成由6個連接蛋白組成的半通道，然后轉運至細胞膜聚集形成GJ。Cx43的磷酸化修飾主要發生在細胞質的羧基末端（carboxyl terminal，CT），它通過調節Cx43的折疊、運輸、積聚、對接和降解，進而直接或間接影響GJJC［2-4］。本文主要對Cx43的CT磷酸化修飾調控Cx43蛋白功能及其對GJIC的影響以及Cx43在腦缺血中的作用進行綜述。

1 Cx43的結構特點及生理功能

Cx43由382個氨基酸組成，含有四個α-螺旋跨膜結構域。Cx43從N端至C端出入細胞膜共四次，形成兩個細胞外環（extracellular loops，EL1、EL2），一個胞質環（cytoplasmic loop，CL），以及朝向細胞質的 N-末端（amine terminal，NT）和 C-末端［5］。Cx43處于動態變化過程，半衰期大約1.5～5.0 h，它首先在內質網核糖體上合成，然后被運輸到高爾基復合體，最后在細胞膜上聚集形成Cx43半通道。兩個Cx43半通道在細胞膜相互錨定后對接在一起，形成一個直徑約1.5～2.0 nm的親水性通道，即GJ。Cx43形成的GJ通道允許分子直徑＜1.5 nm和分子量＜1.2 kDa的小分子物質通過，如無機離子（Na+、K+、H+等）、代謝物、第二信使（如Ca2+、cAMP、cGMP、IP3）、micro RNA和其他信號分子［6-7］。多個GJ聚集在一起，形成斑片狀，GJ斑的數目決定了細胞間通訊功能的差異。相鄰細胞間通過GJ所介導的GJIC進行著信號傳遞、物質及能量交換，對細胞的內環境穩定、新陳代謝、增殖和分化等生理過程起著重要的調控作用［8-9］。在中樞神經系統（central nervous system，CNS）中，各種類型神經細胞之間存在著不同類型的GJ，使得神經細胞間形成高度互連的網絡。星形膠質細胞的GJ允許離子和代謝物快速在細胞之間交換，對K+和谷氨酸的緩沖，Ca2+波傳播和突觸可塑性至關重要［10-11］。未配對形成GJ的Cx43連接蛋白可以作為半通道，負責向細胞外環境釋放包括ATP、谷氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和D-絲氨酸等膠質遞質［12］，從而對神經元和神經膠質細胞之間的營養物質代謝和電信號傳導起重要作用。

2 Cx43羧基末端磷酸化修飾在其縫隙連接中的作用

作為相對保守的基因和蛋白質家族，Cx43之間的區別主要在于胞質CT的長度和序列。Cx43 CT是Cx43序列上長約150個氨基酸，占整個Cx43蛋白的39%。Cx43 CT富含脯氨酸和絲氨酸的成分，使得CT成為蛋白質相互作用和蛋白激酶的潛在靶標，對于調控GJIC的功能至關重要［13］。Cx43蛋白的CT肽鏈包含了復雜的磷酸化位點，是Cx43磷酸化的主要區域。在穩態細胞的生命周期中，Cx43 CT的磷酸化狀態除了快速調節通道的開放/閉合狀態，還可通過影響Cx43的合成、轉運、聚集/解聚和降解等不同環節［14-20］，改變活化通道數量，最終實現對縫隙連接功能的調控。例如，在體外培養的HeLa細胞中，轉染了Cx43 CT突變體后，與正常Cx43 CT相比，Cx43轉運到細胞膜形成GJ的效率明顯下降［21］。PKA通過與Ezrin蛋白形成復合物，靶向調控Cx43 CT的Ser369和Ser373位點，刺激cAMP生成進而增強細胞間的GJIC［22］。SLAVI等［23］將出生后7～12 d的小鼠放置于75%氧氣中5 d誘導視網膜病變，缺氧后雖未觀察到視網膜處Cx43半通道的開放，卻發現星形膠質細胞之間的GJ偶聯增加。導致這一現象的原因是酪蛋白激酶1δ（casein kinase 1delta，CK1δ）使 Cx43 Ser325/328/330位點磷酸化，加速Cx43半通道裝配成GJ斑，導致星形膠質細胞之間的GJ偶聯增加。

Cx43 CT的磷酸化修飾除了使GJIC增強，也可抑制GJIC。有研究表明，病毒癌基因編碼的蛋白酪氨酸激酶v-Src使Cx43 CT中Tyr247和Tyr265位點的磷酸化，從而抑制GJIC［11］。一方面原癌基因編碼的c-Src蛋白通過激活G蛋白偶聯受體來破壞細胞間的GJIC［24］，另一方面通過c-Src SH2結構域與Cx43 Tyr265相互結合并使Cx43磷酸化后，抑制Cx43和緊密連接蛋白1之間的內源性相互作用，從而抑制GJIC［25］。細胞生長因子誘導的GJIC抑制過程同樣也受到Cx43 CT磷酸化修飾的影響。例如表皮生長因子通過MAPK介導的Cx43 Ser255，Ser279 和 Ser282 處磷酸化而快速抑制 GJIC［26］；血小板衍生生長因子誘導的GJIC抑制涉及MAPK和PKC信號通路的激活［27］。

3 Cx43及其縫隙連接通道在腦缺血中的作用

3.1 Cx43在腦缺血中的變化 Cx43是腦組織中含量最豐富的縫隙連接蛋白之一，是星形膠質細胞通過形成縫隙連接和半通道發揮各種生理功能所必需的，在腦缺血發生發展中的作用受到越來越多的關注［28］。在光化學誘導的大鼠皮質缺血模型中，缺血后1 d，梗死周圍感覺皮質Cx43 mRNA水平減少；而缺血后3～7 d，Cx43 mRNA水平逐漸升高。免疫組化顯示缺血后1～14 d，Cx43免疫活降低；缺血后30～120 d，Cx43免疫活性恢復至缺血對側部位水平［29］。LI等［30］發現在大鼠全腦缺血10 min再灌注4～48 h后，海馬CA1 Cx43蛋白水平降低。然而，目前的研究數據表明，缺血后腦內Cx43的變化不盡相同。在小鼠大腦中動脈永久性閉塞后2 h和3 h，皮質核心缺血區Cx43蛋白表達顯著增加；然而，在6 h后Cx43水平顯著降低，這種減少可能是由于缺血區域的細胞死亡伴隨Cx43的降解［31］。在低氧/腦缺血損傷新生鼠中，缺血腦組織Cx43在低氧/腦缺血損傷后4 h升高，在低氧/腦缺血損傷后7 d進一步升高，總Cx43水平幾乎升高18倍，表明Cx43在腦缺血損傷病理生理過程的早期（24 h內）和晚期（24 h至數周）都發揮作用［32］。Cx43在缺血性卒中后的變化，可能與缺血的時間、缺血的部位以及組織損傷的程度有關。此外，很多研究只是觀察總的Cx43水平，并未觀察Cx43的磷酸化水平變化。

3.2 Cx43及其縫隙連接在腦缺血中的作用 Cx43在腦缺血中的作用仍存在爭議。在特異性敲除星形膠質細胞Cx43的小鼠中發現，與野生型小鼠相比，Cx43（+/-）小鼠大腦中動脈遠端閉塞后4 d缺血半暗帶區神經細胞凋亡加劇，小鼠腦梗死體積增大［31］。筆者認為Cx43（+/-）小鼠大腦中，缺乏Cx43的星形膠質細胞可能無法通過縫隙連接從缺血核心病變中清除細胞毒性物質和凋亡起始因子，從而導致Cx43（+/-）小鼠表現出嚴重的腦卒中病變，這表明星形膠質細胞之間的GJIC在缺血損傷的病理過程中發揮著重要作用［33］。Cx43除了形成細胞間縫隙連接外，未形成縫隙的連接蛋白還可能形成半通道，運輸釋放ATP、谷氨酸和谷胱甘肽等物質到周圍環境。LIN等［34］發現在小鼠的大腦中動脈閉塞模型中，低氧預處理具有神經保護作用，敲除Cx43的小鼠模型則對低氧預處理不敏感。結果顯示低氧預處理減少了Cx43的降解，導致質膜Cx43半通道的數量顯著增加，ATP通過半通道外流導致其分解代謝產物腺苷的積累，從而達到神經保護作用。有研究顯示Cx43的神經保護作用主要受它的CT區域調節，Cx43 CT的磷酸化位點在縫隙連接組裝和活性中起重要作用。在截斷Cx43 CT258位殘基的突變小鼠中，截斷CT段這個區域可以去除CK1、PKA、PKC和多數MAPK磷酸化的位點；同時與Src、PDZ zona occludens 1結合的區域也被去除［35］。研究結果顯示，與野生型小鼠大腦中動脈閉塞模型相比，Cx43 CT區域突變導致小鼠大腦中動脈閉塞模型梗死體積更大，皮層梗死半暗帶區域星形膠質細胞增生減少，小膠質細胞數量增加。同時，與野生型小鼠相比，Cx43 CT區域突變導致小鼠皮層Cx43蛋白表達降低；此外，Cx43 CT區域突變形成縫隙連接通道減少，半通道活性降低［35］。

然而，也有學者認為Cx43半通道是“病態孔”，在細胞應激異常時開放［36-38］；當致病因子在應激細胞中積累時，可通過縫隙連接實現從細胞到細胞的擴散，影響疾病病理改變，促進損傷的擴散。有研究證明刺激誘導Cx43半通道開放后，可導致神經毒性物質釋放［28］。在大腦缺血條件下，受損神經元釋放出大量的ATP，在缺血性半暗帶區，從缺血核心區域星形膠質細胞Cx43半通道釋放的ATP將誘導神經元的進一步損傷［39］。FRANTSEVA等［40］在體外缺血模型中研究發現將海馬切片浸入缺氧-低糖的培養基中48 h后，用反義寡核苷酸抑制Cx43的表達可顯著減少缺氧-低糖誘導的神經細胞死亡。XIE等［41］在大鼠MCAO模型證實腦缺血后3 d和7 d海馬Cx43表達明顯上調，通過下調Cx43可顯著增加海馬錐體神經元的存活率并改善行為學評分，減輕梗死同側海馬的萎縮。LI等［32］的研究發現，在低氧/腦缺血損傷新生鼠中，缺血腦組織Cx43蛋白水平增加；抑制Cx43縫隙連接可以顯著縮小梗死體積，減輕缺血皮層和紋狀體膠質細胞的激活，恢復其缺血后的神經功能。在小鼠大腦中動脈閉塞模型中，阻斷Cx43半通道可以縮小小鼠皮層梗死體積；同時，敲除MAPK激酶位點的Cx43S255/262/279/282A（MK4）也可以導致皮層缺血區域星形膠質細胞Cx43半通道活性降低，縮小小鼠皮層梗死體積［42］。因此，細胞縫隙連接允許細胞毒性物質通過，也將所需的物質傳遞到需要的區域，同時也緩沖興奮性氨基酸和離子的細胞毒性水平。這兩種理論可能都是正確的，而決定縫隙連接是保護性還是破壞性作用的關鍵因素可能取決于腦缺血部位正常細胞與損傷細胞的比例。

4 調控Cx43在腦缺血防治中的可能策略

越來越多的研究提示，Cx43在腦缺血損傷中發揮著重要的作用。由于干預Cx43的表達及其形成的縫隙連接可能影響腦缺血的預后，Cx43被認為是治療腦缺血的潛在干預靶點。例如，甘珀酸是一種非特異性的Cx43半通道阻滯劑。已有研究表明，在氧糖剝奪/復氧的細胞損傷模型中，星形膠質細胞半通道活性升高，廣泛釋放谷氨酸，從而增加活性氧（ROS）的產生，最終導致細胞死亡。而甘珀酸的加入，可以阻斷谷氨酸的釋放、增加興奮性氨基酸轉運體1的水平和下調谷氨酰胺的表達［43］。此外，甘珀酸可以抑制Cx43半通道開放和ATP的釋放，并將激活的小膠質細胞的表型從M1轉換為M2，從而在缺血性卒中后提供有效的神經保護［44］。

Cx43模擬肽是以GJ的胞外環或胞內環為靶點的一段堿基序列，包括Gap19、Gap26、Gap27等，可以作為Cx43半通道阻滯劑。Gap26、Gap27對應于Cx43的胞外環中的一段序列，可抑制Cx43縫隙連接通道的形成。新生大鼠腦缺氧/缺血損傷后8小時至7 d，缺血部位Cx43的表達持續增加。在模型制備前1 h腹腔注射Cx43模擬肽Gap26（10，25，50 μg/kg）或Gap27（25 μg/kg）可顯著縮小腦梗死體積。缺血后24 h腹腔注射Gap26（25 μg/kg），改善了新生大鼠運動協調和促進空間記憶能力的功能［32］。Gap19對應于Cx43的胞內環中的一段序列，可能干擾Cx43的C-末端尾部和CL的相互作用。有研究表明，Gap19可以縮小小鼠大腦中動脈栓塞模型的腦梗死體積，防止神經功能缺損的惡化，減輕白質損傷。此外，筆者還發現Gap19的神經保護作用明顯強于Gap26，可能與Gap26和Gap27不僅抑制Cx43半通道，也抑制Cx43縫隙連接通道有關［45-46］。

為了使模擬肽能夠通過血腦屏障進入大腦發揮作用，有研究人員對Cx43模擬肽進行了修飾。例如，在小鼠腹腔注射Gap19-TAT-生物素（7.5 μmol/kg）10 min后，在血管周圍基底層檢測到Gap19-TAT-生物素；80 min后，Gap19-TAT-生物素存在于GFAP陽性的星形膠質細胞中，并與Cx43共定位。在大腦中動脈永久閉塞后2 h，腹腔注射0.75 μmol/kg或7.5 μmol/kg Gap19-TAT分別顯著縮小大腦梗死體積［42］。

5 結語與展望

縫隙連接蛋白的功能異常與多種疾病發生、發展密切相關，已是生命科學領域的研究熱點［1，47-49］。縫隙連接蛋白家族成員各自有獨有的特征，主要歸因于它們CT的差異。Cx43 CT是所有連接蛋白中研究最廣泛的一個結構域，Cx43 CT結構域的研究對于深入探索其它20種人類細胞縫隙連接蛋白CT的功能，將提供更多的線索和借鑒。Cx43 CT的磷酸化影響了Cx43的轉運、GJ的組裝和降解、GJ通道的門控，可作為細胞間縫隙連接開放或關閉的標志，在腦缺血的發生和發展過程中發揮重要的作用。雖然Cx43及Cx43 CT的磷酸化在腦缺血中的具體作用機制還有待明確，但是Cx43作為細胞間最重要的通訊方式之一，當其表達變化出現異常時，勢必會影響神經細胞應對環境的刺激或改變。因此，進一步了解Cx43半通道及其所形成縫隙連接通道，將有助于探討Cx43連接蛋白家族在疾病中的作用機理，為腦缺血及相關中樞神經系統疾病提供方向和治療策略。