干細胞移植治療缺血性腦卒中的研究與進展

廖益東 王梓力 陳光唐 王旭東 徐卡婭

1貴州醫科大學（貴陽 550004）；2貴州醫科大學附屬醫院（貴陽 550004）

缺血性腦血管病已成為全球死亡及致殘的主要原因［1］。我國每年有240萬患者，110萬患者死于腦梗塞，大約只有5%的患者能使用目前的治療方法治療。缺血性腦卒中主要是由一根或多根腦動脈阻塞引起的［2］。血液供應不足會降低腦細胞所需的葡萄糖和氧氣，并破壞細胞內穩態，最終導致神經元死亡，從而導致神經功能的缺失。目前的治療方法包括動靜脈溶栓、血管內支架成形術、血管內介入治療及外科手術等，但通常受限于梗塞治療的時間窗（發病急性期4.5～6 h內）及嚴重的出血并發癥［3］。盡管經使用上述的方法積極治療后，許多患者仍然遺有殘疾。急需開展新的基礎或臨床研究，以便能探索出一種更有效、更安全的治療方法，可以提高患者生活質量，從而減輕社會醫療負擔，這對我國國民經濟的發展有重要意義。缺血性腦卒中的特征性變化是腦動脈閉塞后導致神經元的急性喪失以及突觸結構的破壞［4］。由于神經細胞的更新能力有限且轉換緩慢，內源性細胞替代不足以修復受損的神經元，因此干細胞療法已成為治療缺血性腦卒中最有前景的方法。干細胞是具有自我更新、高度增殖和多系分化的細胞群體，能夠產生高度分化的功能子細胞，可以通過分泌各種神經營養因子和替換受損的神經元、通過抑制顱內外炎癥反應和抗細胞凋亡發揮神經保護作用，還可釋放細胞營養生長因子等增強內源性修復機制的物質而起到神經保護及修復的作用。

1 移植干細胞治療腦卒中可能的作用機制

目前認為干細胞的作用機制可能有：（1）細胞的替代作用：恢復神經功能最直接的方法就是運用干細胞中新分化的神經細胞替換受損的組織。經研究證實，移植后的干細胞進入腦組織結構中，能夠在特定條件下進行分化，代替損傷的神經細胞，促進神經的傳導作用以及連接結構的重新建立。（2）促進血管生成：腦卒中的治療不光需要神經組織的恢復，還需要開通血管，其中新生血管數量與患者的生存期呈正相關，因而提示血管再生是神經功能重構的重要機制。ZHANG等［5］發現90 d內的血管體積從中風前的3%增加到中風后的5.7%，在梗死區周圍也觀察到了毛細血管生成。此外，干細胞還可以通過調節Notch1和免疫調節細胞等的表達，來發揮其在血管生成中的作用。所以干細胞有可能調動了機體免疫細胞的能力，如調節性T（Treg）細胞來達到其有益目的，這是今后研究的熱點［6-8］。（3）免疫和炎癥的調節作用：在腦缺血性卒中后，大量的巨噬細胞和小膠質細胞被動員起來，并持續聚集到損傷區域。這類細胞有兩種表型，分別是M1和M2，表型為M1基因的小膠質細胞和巨噬細胞分泌促炎癥細胞因子，抑制神經元、突觸的再生，不利于神經功能恢復。而表型為M2基因的小膠質細胞和巨噬細胞能夠減輕局部炎癥反應，清除細胞碎片，并釋放大量營養因子來促進血管、神經細胞重塑，從而實現神經功能恢復［9-10］。在最近研究中發現小膠質樣細胞已經從培養的人類胚胎干細胞和誘導性多能干細胞衍生而來，說明干細胞可以促進小膠質樣細胞增殖分化［11］。此外干細胞也可分泌抗炎細胞因子和調控少突膠質細胞介質釋放，通過免疫介導作用減弱神經性炎癥［12］。總體來說，干細胞極有可能是通過免疫調節，降低了顱內外炎癥反應，調動有益的免疫細胞，來介導卒中后患者神經功能恢復。（4）抗凋亡作用：這種作用可能是通過調控血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、腦源性神經營養因子和神經生長因子等營養因子的表達來實現的［7，13］。移植干細胞治療缺血性卒中的作用機制可能有促進血管生成、免疫調控、對抗細胞凋亡等。見圖1。

圖1 移植干細胞治療缺血性腦卒中的可能作用機制Fig.1 The possible mechanism of stem cell transplantation in the treatment of ischemic stroke

2 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs屬于成體干細胞的一大類型，運用最為廣泛，獲取輕松，便于保存，同時MSCs還具有免疫源性低、多項分化潛能等優勢。隨著研究進展人們認識到，腦血管病的亞急性期，動脈閉塞后導致神經元急性喪失以及突觸結構的破壞，干細胞能釋放的高度分化的功能子細胞和生長因子，能降低內源性神經炎癥，減少興奮性的神經毒性，調控腦內微環境來指導小膠質細胞抗炎，從而起到神經保護及修復作用［14-15］。最新研究表明過度上調水通道蛋白4（AQP4）會引起血腦屏障的損壞，MSCs能夠下調AQP4，來減輕血腦屏障的破壞，更加有益于病變部位新皮質的生成［16］。體內研究還表明，在缺血性腦卒中大鼠體內注射MSCs能減輕血腦屏障的滲漏，調控免疫系統和旁分泌機制來促進神經功能的恢復［17-18］。隨后SAVITZ等［19］應用骨髓來源的自體干細胞群ALD-401通過頸內動脈注入穩定期缺血性腦卒中患者顱內血管，未出現任何的安全問題和緊急不良事件，驗證了該自體MSCs對于臨床患者是具有安全性的。筆者思考，頸內注射改變了原有血流動力學，大規模應用是否可能引發新的血栓，這都需要大量的基礎實驗和臨床研究數據來提供有力證明。LEE等［20］也運用靜脈途徑注射自體MSCs，隨訪五年后得出，這種干細胞移植策略對腦卒中患者是安全和有效的。綜上述研究，中樞神經系統及顱內外炎性反應在缺血性腦卒中的發生發展起著關鍵的作用，MSCs能通過遷移作用存活在缺血區域，同時發揮免疫調節作用來對抗腦卒中后顱內炎癥反應，調節Treg細胞增殖，這種MSCs細胞治療劑，可能在腦血管疾病治療中發揮巨大潛力［7］。總體來看，干細胞要想大規模應用需要不同的實驗方法以及不同國家的人群進行移植，獲取可靠研究數據，并且還需妥善解決治療時間窗、移植途徑、細胞劑量等問題。目前臨床運用主要的移植途徑分為立體定位注射、外周血注射及腦脊液循環注射，目前研究表明，腦卒中急性期通過外周血注射的患者受益更大，因此，缺血性卒中的不同時間窗移植干細胞，來觀察它的療效是非常必要的［21-22］。相信隨著干細胞治療腦卒中的不斷深入，局限性問題將在將會迎刃而解。

3 納米材料在干細胞移植傳遞和調控中的作用

納米顆粒（直徑10～100 nm），因其尺寸和形狀可調節，具有較大的表面積，有利于細胞或者分子（藥物、抗體）附著及可攜帶多種生物配體。臨床研究表明，使用聚合物涂層涂抹納米顆粒表面，更加提高了生物利用度，正是由于材料的特性，超順磁性氧化鐵納米顆粒（Surparamagnetic iron oxidenanoparticles，SPIONs）的導入才能實時監測治療效果，成為干細胞移植治療領域的又一重大發現［23-24］。另一方面納米材料作為干細胞移植的傳遞體，更加有利于改善干細胞存活和歸巢、調控干細胞的行為及誘導其分化、增強干細胞的旁分泌等［25］。目前干細胞移植最大難題就是真正遷移到靶區細胞數量少，納米材料的應用增加了細胞的運載數量［26］。與此同時，納米材料的生物特性可調節干細胞的行為和腦內局部微環境，從而提高移植干細胞體內存活率。其可能的原因如下，納米材料附加了某些生物活性分子，而且自身也具有一定生物活性。據可靠研究表明附加的生物活性分子包括化學小分子藥物、核酸類藥物、肽類藥物、干細胞因子等［27］，見圖2。為了使干細胞能更好地運用于臨床，需要開發多類型的新型材料、或者涂層材料搭載干細胞進入體內發揮作用。

圖2 附加于納米材料的各類活性分子、藥物的負載方式Fig.2 Loading methods of various active molecules and drugs attached to nanomaterials

4 移植后干細胞追蹤方法及臨床應用 磁共振成像

MRI是干細胞移植臨床追蹤的最有前途的無創成像方法之一。為了通過MRI追蹤移植的干細胞，需要使用造影劑標記，以獲得足夠的信號強度差異，才能在MRI顯示出來。經過多項研究發現超順磁性氧化鐵（SPIO）納米顆粒成為干細胞標記的首選［28］。研究發現，具有中空結構的錳磁性納米粒子（MnOHo）并用β1抗體對其進行了修飾，在干細胞注射前使用預先進行標記，注射進小鼠體內后通過MRI檢測，MnOHo依然存在于標記的干細胞中，證明了MnOHo對轉基因干細胞具有生物安全、高效標記，多重檢測的優點，從而能夠在臨床前對移植的人類干細胞進行微創監測［29］；ZHANG等［30］還向卒中小鼠的大腦內注射了熒光介導的二氧化硅涂層來包裹SPIO，標記的干細胞，發現熒光修飾的SPIO對干細胞進行了高效的跟蹤，這種方法有望在MRI應用中取得巨大成功。然而，又有報告指出SPIO的局限性就是隨著細胞分裂的進行，SPIO的濃度會減半，導致信號減少，影響MRI結果的準確性，這對長期追蹤造成了很大的阻礙［31-32］。總體而言，MRI雖然具有非侵入性的優點，但是標記物容易隨著細胞的分裂而削弱，需要和納米顆粒或基因修飾進一步整合，提高它的特異性，以便更加適合其臨床應用，這是未來干細胞成像的新趨勢。

5 思考與展望

2014年“干細胞及轉化研究”被列為國家重點研發計劃，為干細胞治療缺血性卒中提供了豐富的理論依據和技術支持。然而，目前干細胞應用于缺血性卒中治療的臨床試驗大多數都是短期案例研究，缺乏長期的全面的臨床數據分析。但是大量的動物試驗已經證實了干細胞治療缺血性腦卒中的一個可行性、安全性和先進性，如何將動物試驗與臨床應用結合是目前棘手的問題。現如今，干細胞治療腦缺血性卒中的機制仍不明確，還可能存在的機制如：干細胞是如何將健康線粒體定向歸巢至靶細胞以挽救受損細胞，從而調控免疫細胞，減輕了顱內外源性炎性反應，這些修復的機制還有待深入研究。隨著我們國家人民對醫療水平的需求，還需要結合臨床實踐經驗，思考注射的干細胞劑量對患者的療效，以及適宜時間窗的選擇及移植途徑等問題。最新研究表明可采用納米新型材料搭載移植干細胞，該材料具有很多優勢，不僅減少了干細胞損失率、還調控了顱內微環境，讓更多的干細胞到達受損靶點發揮治療效應。但是遞送干細胞藥物產品的臨床運用可能存在免疫排斥，生物相容性、血管化等問題仍然面臨挑戰。未來干細胞的成功運用，不僅需要到臨床實踐中發現問題，而且還要不斷的回歸到基礎研究中解決問題，這樣才能為顱內移植干細胞治療神經系統疾病提供新的理論依據，為缺血性腦卒中防治提供潛在的應用靶點。