黏膜相關恒定T細胞比例與慢加急性肝衰竭患者預后的關系

薛紅 李晗 田李均 邵建國 卞兆連

南通大學附屬南通第三醫院1重癥感染科，2重癥醫學科，3消化科（江蘇南通 226006）

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指在既往已知或未知的慢性肝病基礎上出現急性肝功能損傷，以腹水、黃疸、門脈高壓等癥狀為主的臨床綜合征［1］，預后差，病死率高（50%～90%）［2］。因此，早期識別肝衰竭患者的不良預后，對臨床治療、減少并發癥具有重要意義［3］。

黏膜相關恒定T（mucosal associated invariant T，MAIT）細胞是一類獨特的先天性T細胞，它們在黏膜組織和外周血中大量存在，在人類肝臟中高度富集［4］。筆者前期研究表明［5］，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關肝衰竭患者MAIT細胞明顯減少。然而，非HBV感染肝衰竭患者MAIT細胞變化并不清楚。因此，本文將對ACLF患者MAIT細胞變化及其預測預后價值進行研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2018年9月至2019年9月在南通市第三人民醫院住院的51例ACLF患者資料。其中男33例，女18例，平均年齡（49.29±11.38）歲。所有患者均予保肝退黃等內科綜合治療，依病情需要給予人工肝、持續血液濾過治療。ACLF診斷標準參照肝衰竭診治指南（2018年版）［6］：凝血酶原活動度≤40%（或國際標準化比值≥1.5）；血清總膽紅素水平超過10倍正常值或每日上升≥17.1 μmol/L。根據不同慢性肝病基礎分為3型，A型：在慢性非肝硬化肝病基礎上發生的ACLF；B型：在代償期肝硬化基礎上發生的ACLF；C型：在失代償期肝硬化基礎上發生的ACLF。納入標準：（1）ACLF患者；（2）年齡＞18歲；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）妊娠或哺乳期 婦女；（2）合并HIV、結核感染；（3）患有原發性肝癌或其他惡性腫瘤；（4）合并嚴重肺、心臟或其他器官障礙的患者。收集同期醫院體檢中心健康體檢者作為對照組（n=30）。研究方案獲得南通市第三人民醫院倫理委員會批準（批號EL2018002）。

1.2 試劑 淋巴細胞分離液（Ficoll-pague）購自美國GE公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，PBS緩沖液及胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，CD3、CD161、Vα7.2抗體購自美國Biolegend公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 所有ACLF患者和健康對照者均空腹6～8 h，行血常規、炎癥指標等生化檢測。MELD評分計算公式：MELD評分=9.6×ln［SCr（μmol/L）］+3.8×ln［TBIL（μmol/L）］+11.2×ln（INR）+6.4×（膽汁或酒精性肝硬化為0，其他病因為1）［7］。

1.3.2 外周血單個核細胞的分離 采集外周血5 mL，血樣6 h之內通過密度梯度法分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。20℃3 000 r/min離心10 min，收集淺黃色涂層界面層添加到裝有3 mL Ficoll的15 mL離心管中，然后，將離心管在860rcf和20℃條件下離心30 min，用PBS緩沖液洗滌后，在300rcf下離心10 min收集PBMC，并將其放在有10%二甲基亞砜的胎牛血清中，存入液氮以供進一步分析。

1.3.3 流式細胞術檢測MAIT細胞的比例 將CD3、CD161、Vα7.2抗體進行滴定后按適當比例混合，每1×106個PBMC中加入50 μL混合抗體，室溫、避光染色30 min。根據文獻［8］定義外周血MAIT細胞表型：CD3+CD161+Vα7.2+。流式細胞術分析用流式細胞儀（BD Biosciences）進行。數據分析采用FlowJo軟件。檢測MAIT細胞占CD3+T細胞的比例。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.0軟件對數據進行統計學分析。計數資料以例數和百分數表示，比較采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用非配對t檢驗。使用二元logistic回歸分析ACLF患者預后的危險因素。采用Kaplan-Meier繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較 ACLF組和對照組在性別、年齡、白細胞計數和淋巴細胞計數方面差異均無統計學意義（P＞0.05）；ACLF組患者谷丙轉氨酶、天門冬氨酸轉氨酶和總膽紅素顯著高于對照組，白蛋白和血小板計數顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 對照組和ACLF組基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data between control group and ACLF group ±s

表1 對照組和ACLF組基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data between control group and ACLF group ±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.001；“-”無相關數據；ALT，丙氨酸轉氨酶；AST，天冬氨酸轉氨酶；TBIL，總膽紅素；ALB，白蛋白；PLT，血小板；PT，凝血酶原時間；INR，國際標準化比值；PTA，凝血酶原活動度；CRP，超敏C反應蛋白

項目例數年齡（歲）性別（男/女）ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）前白蛋白（mg/L）膽堿酯酶（U/L）PT（s）INR PTA（%）白細胞計數（×109/L）淋巴細胞計數（×109/L）血小板（×109/L）肌酐（μmol/L）CRP（mg/dL）對照組30 45.30±15.01 16/14 15.87±5.53 21.77±5.25 12.67±3.65 43.23±2.59 χ2/t值--1.340 1.022-4.124-4.296-11.120-21.795 P值-0.184 0.312 0.000 0.000 0.000 0.000---------------5.98±1.79 2.54±0.81 192.90±46.39-0.833 0.241 8.056 0.407 0.810 0.000--ACLF組51 49.29±11.60 33/18 480.71±615.71 419.12±505.28 319.60±135.76 30.78±3.59 64.00±35.73 2 949.25±1 404.36 24.89±8.34 2.19±0.75 30.83±9.08 6.66±4.19 2.35±4.23 98.75±53.18 88.53±130.54 15.53±16.51----

2.2 兩組外周血中MAIT細胞的比例比較 從流式FSC/SSC散點圖中圈出淋巴細胞，然后選取CD3+細胞設門，再選擇CD3+CD161+Vα7.2+細胞作為MAIT細胞（圖1A）。ACLF組的MAIT比例為（2.03±1.19）%，而對照組MAIT比例為（5.07±1.22）%，明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.001），見圖1B。

圖1 ACLF患者及對照組外周血中MAIT細胞的比例比較Fig.1 Comparison of MAIT cell proportion in peripheral blood between ACLF patients and controls

2.3 肝衰竭患者病毒組與非病毒組外周血MAIT的比例 根據病因將ACLF患者分為病毒感染組（n=42）和非病毒感染組（n=9），結果表明，兩組間MAIT細胞比例差異無統計學意義［（2.08±1.27）%vs.（1.82±0.81）%，P ＞0.05］，提示ACLF患者外周血MAIT細胞比例與病毒感染無關。見圖2。

圖2 ACLF患者病毒組和非病毒組患者MAIT細胞的比例Fig.2 The proportion of MAIT cells in viral and non viral patients with ACLF

2.4 不同慢性肝病基礎的ACLF患者外周血MAIT細胞的比例 根據慢性肝病的不同基礎情況，將ACLF患者分為3型A型（n=11）、B型（n=9）和C型（n=31）。比較各組MAIT細胞的比例，結果顯示與A型患者（n=11）相比B型和C型患者（n=40）的MAIT細胞比例低［（1.69± 0.84）vs.（3.29±1.49），P＜0.001，圖3A］。此外，與A型患者相比C型患者的MAIT細胞比例較低［（1.54±0.80）vs.（3.29±1.42），P＜0.001］，C型患者與B型患者相比之間存在差異［（1.54±0.80）vs.（2.18±0.80），P＜0.05，圖3B］。

圖3 不同慢性肝病基礎的ACLF患者外周血MAIT細胞的比例Fig.3 Proportion of peripheral blood MAIT cells in patients with ACLF based on different chronic liver diseases

2.5 影響ACLF患者預后的單因素分析 根據出院后90 d的隨訪轉歸分為好轉組和死亡組，其中好轉組30例，死亡組21例。將影響肝衰竭預后因素如MAIT細胞比例、性別、年齡、總膽紅素、白蛋白、血小板計數、PTA、肌酐、MELD評分等進行單因素二分類logistic回歸分析，結果顯示MAIT細胞比例、年齡、PTA和MELD評分與ACLF預后有關（P＜0.05），見表2。

表2 ACLF患者預后的單因素logistic回歸分析Tab.2 Univariate logistic regression analysis of prognosis in patients with ACLF

2.6 影響ACLF患者預后的多因素logistic回歸分析 將MAIT細胞比例、年齡、PTA、MELD評分納入多因素logistic回歸，結果顯示MAIT細胞比例、MELD評分為ACLF患者預后的危險因素（P=0.015、P=0.021），見表3。

表3 影響ACLF患者預后的多因素logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis on prognosis of patients with ACLF

2.7 不同MAIT細胞比例ACLF患者預后的比較以ACLF患者外周血MAIT比例的中位數作為分界值（1.96%），將ACLF患者分為高MAIT組（≥ 1.96%26例）和低MAIT組（＜1.96%25例），采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。MAIT≥1.96%生存率為80.77%，而MAIT＜1.96%則為36.00%，高MAIT組患者的生存時間明顯高于低MAIT組，兩組差異有統計學意義（P=0.000 3），見圖4。

圖4 不同MAIT細胞比例ACLF患者90 d生存曲線分析Fig.4 Analysis of 90 day survival curve of ACLF patients with different MAIT cell ratios

3 討論

ACLF患者肝組織中大量的肝細胞壞死引起炎癥反應過度激活導致全身炎癥反應綜合征，致使肝外多器官衰竭［9］。幾乎所有類型的免疫細胞都會發生不同程度損傷，包括中性粒細胞、樹突狀細胞、骨髓源性抑制細胞和自然殺傷細胞［10］。SHEN等［11］報道T細胞介導的免疫損傷在乙型肝炎病毒相關ACLF的發病機制中起重要作用。

MAIT細胞是一種進化保守的T細胞，是人類免疫系統的重要組成部分。最近的一項研究還發現，MAIT細胞可能參與新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的免疫發病機制［12］。在NAFLD患者［13］及嚴重酒精性肝炎患者［14］較健康對照組相比，MAIT細胞頻率降低。然而，ACLF患者MAIT細胞免疫功能的改變尚未見報道。在本研究中，通過流式細胞術發現ACLF患者MAIT細胞比例較對照組嚴重降低，這與既往研究［4］一致。由于缺乏ACLF患者的肝臟標本，故無法通過流式細胞術方法確定ACLF患者肝臟中MAIT細胞比例是否較對照組升高，需要進一步開展動物實驗來判斷MAIT細胞是否在肝臟部位聚集。慢性乙型和丙型肝炎病毒是引起肝臟疾病最重要的原因，在不同的病毒感染（如HBV［15］和HCV［16］感染）同樣會導致MAIT細胞水平的顯著降低，筆者推測MAIT細胞的變化可能與ACLF的病因無關。為了明確MAIT細胞的變化是否與病毒感染有關，本研究比較病毒感染和非病毒感染患者的MAIT細胞比例，發現兩者之間沒有差異，說明ACLF患者外周血中MAIT細胞的變化確實與病毒感染無關。近期一項研究［17］發現失代償期肝硬化患者MAIT細胞水平降低，由于晚期肝硬化患者對感染的易感性增加，作為肝硬化相關免疫功能障礙的一部分，MAIT細胞具有對細菌的應答能力。本研究觀察到B型和C型ACLF患者MAIT細胞比例比A型患者明顯下降，而且C型ACLF患者的MAIT細胞比例也比B型患者低。結果表明C型ACLF患者MAIT細胞比例較低，提示外周血MAIT細胞水平可能與ACLF患者慢性肝病的不同基礎情況密切相關。

ACLF患者尚缺乏預測其預后的生物標志物，因此尋找一種更準確、更方便的預后標志物顯得尤為重要。目前用于肝衰竭短期預后的評價有MELD評分、序貫器官衰竭評估模型等［18］，但過于復雜，應用價值有限。為驗證外周血MAIT細胞水平是否可以預測ACLF預后，本研究多因素logistic回歸分析，結果顯示MAIT細胞比例是ACLF患者死亡的危險因素（P=0.015），潛在的機制尚未完全確定。進一步按照MAIT比例的中位數分為高表達組和低表達組，生存曲線分析MAIT≥1.96%組患者生存率為80.77%，而MAIT＜1.96%則為36.00%（P=0.000 3），進一步提示了MAIT細胞水平預測ACLF患者90 d預后的價值。

綜上所述，本研究表明，較低的MAIT細胞水平可能預示著ACLF患者的預后較差，提示MAIT細胞是預測ACLF預后的重要標志物。MAIT細胞的耗盡可能導致免疫抑制，增加機會性感染的風險，從而導致嚴重的后果。本研究存在一些局限性：樣本量較少，僅為單中心研究。期望今后能夠通過大樣本，多中心研究進行驗證，將來成為ACLF免疫治療的靶點。