circRNA在膠質瘤中的研究進展

吳文松 劉超 孫程圓 曾昭穆 溫稀超 鄭克彬

河北大學附屬醫(yī)院1神經外科，2中心實驗室（河北保定071000）

膠質瘤是一種原發(fā)于中樞神經系統(tǒng)的惡性腫瘤，約占中樞神經系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的48%［1］。膠質母細胞瘤的惡性程度最高，患者生存期僅為15個月左右，5年生存率不足5%。將膠質瘤完全切除并進行放療或化療能夠在一定程度上延長患者生存時間，但其具有生物學行為惡性、術后易復發(fā)、對放化療抵抗及生存期短等特點，因此深入探索膠質瘤的發(fā)生發(fā)展機制以及尋找新型治療方法具有重要意義。

circRNA 是一種非編碼RNAs 亞型，其是通過前體mRNA 下游的3′端與上游的5′端反向拼接位點共價連接生成的環(huán)狀RNA 分子，由于其不存在多聚腺苷酸尾，導致早期無法對circRNA 的種類和數量進行測量［2］，近年來高通量測序、微陣列芯片以及生物信息學技術使circRNA 再次進入人們的視線［3-4］。circRNA 在各種疾病中均發(fā)揮著重要功能，可作為基因治療的新靶點，此研究對circRNA在膠質瘤中所發(fā)揮的的生物學作用進行歸納總結，為完善膠質瘤發(fā)生發(fā)展機制及尋找有效治療方案提供了理論支持。

1 circRNA 及作用機制

circRNA 是由RNA 聚合酶Ⅱ合成的［5］，并由剪接體通過反向剪接（back?splicing）的方式對前體mRNA 的外顯子進行加工［6］。主要分為ecircRNA、ciRNA、ElciRNA。當其全部由外顯子組成時稱為ecircRNA，僅由內含子組成時稱為ciRNA，當外顯子與內含子共同存在時則稱為ElciRNA［7］。其具有多種多樣的生物學功能。如調控基因轉錄、海綿吸附miRNA、結合功能蛋白質、作為多元復合物支架以及翻譯蛋白質等功能。

circRNA能夠對基因轉錄進行調控，如circEIF3J和circPAIP2 能夠作用于其同源基因的啟動子區(qū)域來提高轉錄EIF3J和PAIP2的表達［8］。circ?79530與轉錄因子TWIST 結合，進而正反饋促使親本基因生成circ?79530，進而誘發(fā)先兆子癇［9］。當此類circRNA 的表達水平異常時可能導致相應基因表達失調，從而誘發(fā)某些疾病的產生。

circRNA 能夠海綿吸附miRNA，其是一類微小RNA 分子，其核苷酸序列與某些mRNA 進行互補配對，從而抑制mRNA 的翻譯功能，發(fā)揮著生物控制器的作用。而circRNA 存在與miRNA 互補的堿基序列，兩者之間可以進行相互結合以達到對miRNA 的海綿吸附。如cirs?7 能夠吸附miR?7，而miR?7 是多種癌癥通路的關鍵調節(jié)因子，其表達下調引起miR?7 所調節(jié)的癌癥信號通路的異常，進而促進腫瘤生成［10］。此外，胎盤滋養(yǎng)層細胞缺氧誘發(fā)circ?RBM39 上調，通過海綿吸附miR?5088?5p促進滋養(yǎng)層細胞的自噬［11］。可見，當circRNA 水平異常而失去對miRNA 的調控會影響下游通路或基因表達異常，最終導致各種疾病的發(fā)生發(fā)展。

circRNA 亦能與具有生物學功能的蛋白質結合以影響細胞的生物學活性。RNA 結合蛋白能通過與RNA 特異性結合來調節(jié)轉錄、翻譯等功能［12］。cia?cGAS 通過與cGAS 蛋白結合抑制cGAS 的基因的表達，進一步抑制I 型干擾素生成，最終使骨髓中的造血干細胞保持休眠狀態(tài)［13］。此外，circE2F2能夠與HuR 蛋白質分子進行相互結合后使E2F2 mRNA 變得更加穩(wěn)定，從而影響了卵巢癌細胞的增殖、轉移以及新陳代謝［14］。

circRNA 可以作為分子支架募集多種生物分子形成多元復合物發(fā)揮作用。如circNDUFB2 能夠作為分子支架吸引TRIM25 泛素連接酶并提高其活化的效率，使IGF2BPs 癌相關蛋白水平升高，進而促進非小細胞肺癌的侵襲、遷移能力大大提升［15］。當具有分子支架功能的circRNA 含量發(fā)生改變時能對細胞的癌變及生物學特性產生影響。

部分circRNA 具有編碼蛋白質功能。如circ?EGFR 能夠募集核糖體編碼rtEGFR 蛋白以維持EGFR 在細胞膜的位置，進而持續(xù)活化EGFR 信號通路促使細胞發(fā)生癌變［16］，circ?HER2 能夠翻譯HER?103 蛋白提高三陰乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力［17］，circβ?catenin 能編碼β?catenin 蛋白亞型活化Wnt/β?catenin 信號通路導致肝癌的產生并提高肝癌細胞的增殖及遷移能力［18］。由此可以推測circRNA 的翻譯功能并不是主要功能，但細胞內某些編碼癌相關蛋白的circRNA 異常時可能誘發(fā)癌癥的產生。

2 circRNA 在膠質瘤中的生物學作用

circRNA 在多種疾病中均有重要影響，而腦組織中circRNA 的種類和含量最高，多種多樣的生物學功能使circRNA 在膠質瘤中扮演著重要角色，某些circRNA 的異常表達對膠質瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移、血管生成及放化療抵抗方面均有影響，因而circRNA 有可能成為基因治療的靶點。

2.1 circRNA 參與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展circRNA可作為miRNA 海綿影響膠質瘤的發(fā)生發(fā)展，并對其生物學特性進行調節(jié)。如膠質瘤細胞中高表達的circ?MAPK4 海綿吸附miR?125a?3p 使其含量下降，進一步下調p38/MAPK 通路的磷酸化水平以抑制膠質瘤細胞凋亡，相對促進膠質瘤的發(fā)生及進展［19］。此外，高表達的circHECTD1 能夠吸附miR?296?3p 使其表達水平下降使SLC10A7 基因表達升高，促進膠質瘤的發(fā)生發(fā)展［20］。circRNA 還能通過與功能蛋白結合發(fā)揮作用。如CDR1as 與p53 蛋白結合使E3 泛素連接酶MDM2 介導的p53 蛋白泛素化水平升高來下調p53 蛋白的生物學活性，而p53蛋白能夠抑制腫瘤生成，最終促進膠質瘤的發(fā)生發(fā)展［21］。膠質瘤中存在大量的miRNA 海綿吸附機制及蛋白質結合機制，并且一種circRNA 可以吸附多種miRNA 和功能蛋白質來影響相關分子通路的活化水平或致癌基因的表達異常，因此將具有重要致癌功能的circRNA 作為靶點是可選擇的基因治療方法。

膠質瘤細胞中存在有編碼功能的circRNA。如circ?SHPRH 能夠翻譯SHPRH?146aa 蛋白，其能抑制親本基因表達的SHPRH 抑癌蛋白降解，circ?SHPRH 的水平下降使得SHPRH?146aa 生成減少，對SHPRH 蛋白的保護作用下降，導致膠質瘤的發(fā)生發(fā)展［22］。不難看出，編碼癌相關蛋白的circRNA對膠質瘤發(fā)生發(fā)展起到一定作用，但目前在膠質瘤中對編碼circRNA 的研究稀少，其編碼蛋白質的功能仍需進一步研究。

2.2 circRNA 參與膠質瘤的侵襲轉移強大的侵襲轉移能力使膠質瘤細胞擴散到其他部位，甚至遠處轉移，研究表明circRNA 對膠質瘤侵襲轉移能力有不菲的影響。BARBAGALLO 等［23］發(fā)現circ?SMARCA5 能夠與SRSF1 蛋白結合，當膠質瘤細胞內circSMARCA5 表達水平下降導致促癌蛋白SRF1的表達水平升高，導致膠質瘤細胞的轉移能力增強。由此可見，細胞中某些circRNA 能與miRNA 及蛋白質結合提升膠質瘤侵襲、轉移能力。通過某種方法使膠質瘤細胞中circRNA 異常表達恢復正常來抑制侵襲轉移能力可成為一種有潛力的治療方案。

2.3 circRNA 參與膠質瘤的血管生成膠質瘤組織內包含大量滋養(yǎng)血管，豐富血供為膠質瘤提供有力的營養(yǎng)支持以促進增殖、遷移、侵襲能力。circRNA 能夠參與腫瘤組織的血管生成，如膠質瘤組織中過表達的cARF1 能夠通過miRNA 海綿功能降低miR?342?3p 的表達水平來上調轉錄因子ISL2的表達，而ISL2 升高能活化VEGFA 介導的ERK 信號通路促使腦微血管內皮細胞增生，使膠質瘤組織中血供豐富，從而促進其發(fā)生發(fā)展［24］。此外，過表達的circ?ATXN1 使miR?526?3p 水平下調并活化MMP2/VEGFA 通路促使膠質瘤組織血管生成，最終促使膠質瘤的病情進展惡化［25］。將生成活躍的血管作為靶點可作為一種新穎的治療方案，而circRNA 對血管生成過程具有生物學意義，將促使膠質瘤血管生成的circRNA 作為靶點進行治療可以使瘤體的血供減少，最終延緩膠質瘤生長，由此可見，circRNA 可作為與血管生成的分子靶點進行探索。

2.4 circRNA參與膠質瘤放對化療的抵抗circRNA在放化療方面也具有影響力。circNFIX 海綿吸附miR?132使其表達水平顯著降低，而ABCG2為miR?132 調節(jié)的下游分子，其與膠質瘤的化療耐藥有關，因此高表達的circNFIX能夠間接上調ABCG2表達水平，促使膠質瘤細胞產生替莫唑胺抵抗［26］。circRNA 與膠質瘤的放療抵抗也存在關聯。如放療抵抗膠質瘤細胞與敏感膠質瘤細胞相比，circ?VCAN表達水平明顯上調，其能夠負向調節(jié)miR?1183促使膠質瘤對放療產生抵抗性，并且circ?VCAN 的表達過高能使接受過放療的膠質瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力顯著提升［27］。放化療為膠質瘤術后的主要治療，放化療抵抗導致了膠質瘤復發(fā)及患者死亡，circRNA 與膠質瘤對放化療的抵抗性相互關聯，因此其可以作為提高放化療敏感度的靶點進行基因治療，但目前對該方面有待進一步研究。

3 circRNA 在膠質瘤中的應用

circRNA 在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移以及方化療抵抗方面均扮演著重要的角色。不難發(fā)現，circRNA 在膠質瘤中的臨床作用十分廣泛，其在膠質瘤的診斷、治療及預后評估等方面均具有重要影響。

3.1 circRNA 參與膠質瘤的診斷circRNA 不僅存在于細胞內，還可分布于血液中，疾病狀態(tài)時會導致血液中某些circRNA 表達水平異常，可能與膠質瘤的生成具有相關性。膠質瘤患者血漿中circFOXO3、circ?0029426 以及circ?SHPRH 與正常人相比其表達水平存在顯著差異，其中circFOXO3的差異性最為顯著，由此可以看出circRNA 分子對于膠質瘤的診斷是非常由幫助的。室溫下這3 種circRNAs 放置24 h后表達水平也不發(fā)生劇烈改變，將血漿凍存在-80 ℃并反復解凍5 個周期也能保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)［28］。circRNA的穩(wěn)定性與其環(huán)狀結構以及核酸外切酶抵抗密不可分，因此血漿中的某些特異性circRNA 可以作為膠質瘤的診斷標志分子，膠質瘤患者出現臨床癥狀后，顱內侵犯已十分廣泛，所以血漿中circRNA 診斷標志分子對膠質瘤的早期診斷具有重要意義。

3.2 circRNA 參與膠質瘤的治療目前對于膠質瘤的治療主要為手術聯合放、化療。通過手術切除病灶，術后對患者行放化療能夠在某種程度上消除部分殘留的癌細胞，但在接受多次對放化療后，癌細胞產生抵抗性并快速增殖，最終膠質瘤患者復發(fā)死亡。研究表明circRNA 在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移、血管生成以及放化療抵抗作用中均產生巨大的影響，將circRNA 作為基因治療的靶點能夠有效的抑制膠質瘤細胞的各種惡性生物學行為，最終達到治療的目的。LIU 等［29］將特異性靶向circ_0001836 的小型干擾RNA 轉染進入膠質瘤細胞后使其表達水平降低，實驗發(fā)現其水平下降促使NLRP1?GSDMD 信號通路活化，使NLPR1 表達上調并產生活化型caspase?1 的炎性小體，進一步使GSDMD 蛋白活化并與磷酸肌酸結合使細胞膜產生小孔，最終導致的膠質瘤細胞腫脹、裂解而產生凋亡作用。此外，CHEN 等［30］將circ?ITCH 過表達質粒轉入膠質瘤細胞使circ?ITCH表達水平增高，其能夠通過海綿吸附miR?106a?5p 以上調SASH1蛋白的表達水平，而SASH1 蛋白能夠有效抑制膠質瘤細胞的增殖及侵襲能力。放化療抵抗是膠質瘤患者最終死亡的重要原因，YIN 等［31］研究發(fā)現，將高表達的circHIPK3 敲低能夠通過miR?524?5p/KIF2A 介導的PIK3/AKT 信號通路恢復膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性，通過某種方法使患者的膠質瘤細胞中circHIPK3 的表達含量下降能夠相對增強其對替莫唑胺的敏感性，從而延長患者的生存期，改善預后，例如外泌體（exosome）可以作為circRNA 的運載工具［32］，但如何將其運用到臨床治療是一個巨大的挑戰(zhàn)。因而將circRNA 作為治療的靶點是非常有潛力的，其對于促進膠質瘤細胞凋亡或抑制其增殖、侵襲作用非常有效，最終達到有效治療膠質瘤的目的。與此同時，circRNA 靶向治療聯合放化療等治療方案有可能取得更好的治療效果。

3.3 circRNA 參與膠質瘤的預后評估circRNA對于膠質瘤的預后具有重要的影響。膠質瘤患者的預后與瘤組織的大小、WHO 病理分級、生存時間等方面相關。CHEN 等［33］發(fā)現circ_0079586 在膠質瘤細胞中高表達，其表達水平與腫瘤組織的WHO 分級、腫瘤大小具有明顯的相關性，但與患者的年齡、性別、腫瘤部位無關，Kaplan Meier 生存分析提示circ_0079586 高表達患者的總體生存率比低表達患者明顯降低，因此其具有作為膠質瘤患者預后評判指標的潛力。同樣的，CHEN 等［34］發(fā)現circ_0074026 分子也可以作為膠質瘤患者預后評判的一個指標，circ_0074026 高水平表達的膠質瘤患者5年總生存率比低表達患者相比明顯升高，其表達含量的異常升高預示著患者的預后較差并且容易導致膠質瘤復發(fā)和進展。除了作為直接預后評估分子外，其調控的表達產物也可間接反映膠質瘤的預后。如circCPA4 能夠與let?7 進行結合調節(jié)親本基因CPA4 的表達水平，而CPA4 表達產物可以對膠質瘤患者的預后進行評價［35］。由此可見，膠質瘤細胞中某些特異性circRNA 的表達水平與膠質瘤患者的預后評價具有緊密的相關性，其異常表達水平的程度可能與膠質瘤的生存時間、WHO 病理級別、腫瘤大小等方面具有相關性，所以circRNA 可以作為指導臨床診治的分子指向標，但其靈敏性及可靠性有待進一步研究。

4 總結與展望

課題組前期通過對膠質瘤組織及癌旁正常腦組織的表達譜進行分析，通過體外細胞實驗及體外動物實驗發(fā)現circPIP5K1A 在膠質瘤中表達升高，其能夠通過海綿吸附miR?515?5p 分子調控癌相關蛋白TCF12 的生成增多，而表達水平升高的TCF12 蛋白能夠進一步激活PI3K/AKT 信號通路，最終抑制膠質瘤細胞凋亡以及促進其增殖、侵襲轉移以及上皮間質轉化等生物學功能，并且可以作為一種評判膠質瘤預后的分子標志［36］。前期研究結果有助于深入理解膠質瘤凋亡及發(fā)生發(fā)展等機制，同時也為膠質瘤的基因治療提供了堅定可靠的理論依據和實驗基礎。

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，由于其對于放化療的抵抗及極差的預后使得膠質瘤成為了亟待解決的世界性難題。近年來研究發(fā)現circRNA 具有十分廣泛的生物學功能，其在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展以及放化療抵抗機制方面均有重要的現實意義，以circRNA 作為靶點進行深入研究為膠質瘤的診治提供有力的理論支持，但目前人們對circRNA 的認知仍較淺，其生物學作用機制以及作為基因治療的靶點在膠質瘤中的臨床應用還需大量基礎及臨床實驗進行探索驗證，相信circRNA 能夠成為治療膠質瘤的一把新利器。