喂養不耐受極早產兒胎糞中腸道菌群觀察

羅梅娟，胡家奇，魏穎，歐巧群，翁志媛，王麗娜，張又祥

廣州市第一人民醫院華南理工大學醫學院附屬第二醫院兒科，廣州510180

早產兒常伴隨宮內感染、膿毒血癥、呼吸窘迫綜合征等并發癥。近年來隨著新生兒重癥監護技術的發展，早產兒尤其是極早產兒（胎齡＜32 周）的存活率明顯升高。但極早產兒因消化系統發育不成熟、胃腸分泌能力低下、腸道菌群紊亂等因素，在出生后喂養過程中極易出現喂養不耐受（feeding intolerance，FI）。近年來發現，FI 和腸道菌群存在緊密的關系，尤其早產兒早期喂養不耐受，與其腸道菌群定植延遲、種類缺乏，尤其是乳酸桿菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）缺乏有關。有別于傳統的DGGE法、熒光定量PCR法等檢測腸道菌群，高通量測序技術通過細菌16S rDNA 的不同特異區段進行擴增和測序，進而獲得更多的高質量的菌群基因組信息。隨著高通量技術的發展，腸道菌群在極早產兒中的作用漸漸被肯定，在極早產兒的免疫性疾病、過敏性疾病、代謝等方面均發揮重要作用［1，2］。本研究采集FI 的極早產兒胎糞進行高通量測序，分析其腸道菌群的特征。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年12月間廣州市第一人民醫院住院的早產兒24 例。極早產兒納入標準［3］：①胎齡＜32周；②胎盤病理診斷完整；③同意參加本研究。極早產兒排除標準：①存在先天畸形或者染色體異常；②出生后因病情危重或其他因素放棄治療或死亡。FI 診斷標準：①喂養3 h后胃內殘留量仍大于上次喂養量的50%，且每次喂養量均不小于下列各體質量范圍的最低喂養量（體質量＜500 g者2 mL、500～749 g 者3 mL、750～1 000 g者4 mL、＞1 000 g 者5 mL）；②嘔吐≥3 次/天；③胃殘液或嘔吐物為咖啡樣液體；④禁食＞2 次/天；⑤腹脹（腹圍24 h內增加≥1.5 cm，有腸型）、胃內殘留或嘔吐膽汁樣物、大便潛血陽性均需同時合并其他FI 癥狀。符合上述情況之一明確診斷為FI［4-5］。24 例極早產兒中喂養耐受（feeding tolerance，FT）組8 例，其中男4 例、女4 例，出生周齡為（30.62±1.05）周，出生體質量為（1 426.25±255.48）g；FI組16例，其中男9例、女7例，出生周齡（30.25±1.17）周，出生體質量為（1 400.62±188.74）g。兩組性別、出生周齡和出生體質量具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準同意。

1.2 兩組出生時胎糞中腸道菌群檢測及菌群豐度測算 兩組患兒出生24 h內使用無菌糞便采集管收集患兒糞便，-80 ℃冰箱凍存，利用Qiagen 公司Stool DNA 提取試劑盒提取糞便DNA，DNA 提取完成后行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度和濃度，無降解、無RNA 污染、雜帶為合格樣本，合格DNA 用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的DNA 為擴增模板，引物為16SV4 區段515F-806R（F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' 806：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）反應程序設置為：98 ℃預變性1 min；30 個循環（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min，使用New England Biolabs 公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 進行擴增，所得PCR 產物用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測質量）；選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列，進行膠回收目標條帶。產物純化使用Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒。

1.2.1 兩組腸道菌群chao 1 指數、shannon 指數測算 采用高通量測序法。使用New England Biolabs公司的NEB Next? Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit 3.0 熒光定量儀定量和文庫檢測合格后，使用HiSeq 2500系統進行上機測序。測序完成后原始數據拼接、過濾，以及基于有效數據進行操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，根據OTUs 聚類結果，對每個OTUs 的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

使用Qiime 軟件（Version 1.9.1）計算chao1 指數和Shannon 指數，chao1 指數［6］主要關心樣本的物種豐富程度，表示預測的OTUs 個數；Shannon 指數［7］綜合體現物種的豐富度和均勻度，故指數的高低還會受均勻度影響，樣本中的物種分布越均勻，多樣性越高。

1.2.2 兩組腸道菌群相對豐度測算 根據OTUs聚類結果，對每個OTUs 的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。采用RDP classifier Bayesian 模型［8］對OTU 進行分析，基于SILVA［9］和Greengene［10］數據庫統計樣本門、科、屬等水平的腸道細菌相對豐富，分析細菌的特征。菌群分析及測算由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供技術支持。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據處理，Adobe Illustrator CS5 和Graphpad Primer 7.0 軟件分析繪圖。計數資料用例表示，Shapiro-Wilk 法行正態性檢驗和Bartlett 法行方差齊性檢驗；計量資料以xˉ±s 或者M（Q1，Q3）表示，滿足正態分布及方差齊性后兩組樣本采用獨立樣本t檢驗分析，不符合者采用Wilcoxon 秩和檢驗分析性別差異采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腸道菌群chao 1 指數、shannon 指數比較FI 組、FT 組chao 1 指數分別為1 538.56 ± 545.72、1 052.50±106.86，P＜0.05。FI 組、FT 組shannon 指數分別為7.06±1.51、5.62±1.37，P＜0.05。

2.2 兩組腸道菌群相對豐度比較 FI 組、FT 組門水平上變形菌門（Proteobacteria）相對豐度分別為0.214 913（0.054 596，0.345 245）、0.585 904（0.068 144，0.688 192），厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度分別為0.424 363（0.305 997，0.545 460）、0.288 521（0.179 652，0.540 196），Cyanobacteria相對豐度分別為0.007 401（0.002 593，0.013 151）、0.001 944（0.000 947，0.004 179）、擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度分別為0.189 504（0.067 325，0.339 956）、0.113 030（0.032 838，0.276 445），放線菌門（Actinobacteria）相對豐度分別為0.026 416（0.012 754，0.048 859）、0.015 837（0.010 629，0.030 209），、無壁菌門（Tenericutes）相對豐度分別為0.003 541（0.002 008，0.010 732）、0.002 320（0.000 447，0.004 332），Acidobacteria相對豐度分別為0.003 101（0.001 096，0.004 459）、0.000 617（0.000 422，0.001 203）、未分類菌門（unidentified_Bacteria）相對豐度為0.008 053（0.002 242，0.012 186）、0.002 874（0.001 103，0.006 407），Verrucomicrobia相對豐度分別為0.004 903（0.003 087，0.005 545）、0.001 270（0.000 631，0.003 051），Chloroflexi 相對豐度分別為0.001 547（0.000 404，0.002 278）、0.000 220（0.000 124，0.000 582），其他菌門（Others）相對豐度分別為0.014 432（0.009 767，0.021 013）、0.005 109（0.003 548，0.007 042）。與FT 組比較，FI 組Cyanobacteria、Acidobacteria、Verrucomicrobia、Chloroflexi、Others 相對豐度均增加（z 分別為-2.572，-2.267，-3.307，-2.664，-2.694；P＜0.05）。

FI 組、FT 組科水平上unidentified_Cyanobacteria相對豐度分別為0.007 103（0.002 483，0.010 664）、0.001 916（0.000 898，0.003 927），未分類的梭菌科（unidentified_Clostridiales）相對豐度分別為0.006 705（0.004 183，0.011 612）、0.005 080（0.002 476，0.008 582），消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）相對豐度分別為0.005 691（0.004 349，0.009 316）、0.004 491（0.002 934，0.006 677），毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對豐度分別為0.126 646（0.038 241，0.195 766）、0.047 901（0.020 900，0.106 516），瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相對豐度分 別 為0.077 908（0.022 794，0.126 142）、0.028 069（0.011 878，0.079 476），Others 相對豐度分別為0.514 787（0.367 003，0.610 660）、0.315 008（0.144 328，0.485 203），腸桿菌科（En-terobacteriaceae）相對豐度分別為0.023 791（0.014 400，0.074 555）、0.066 236（0.013 166，0.611 001），腸球菌科（Enterococcaceae）相對豐度分別為0.024 635（0.013 471，0.071 589）、0.048 433（0.012 868，0.092 918），鏈球菌科（Streptococcaceae）相對豐度分別為0.008 245（0.004 672，0.014 918）、0.025 614（0.003 200，0.055 497），伯克氏菌科（Burkholderiaceae）相對豐度分別為0.010 395（0.004 970，0.048 923）、0.004 009（0.002 75，0.141 288），鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）相對豐度分別為0.002 583（0.002 153，0.021 336）、0.002 114（0.001 249，0.122 215）。與FT 組比較，FI組unidentified_Cyanobacteria、Others 相對豐度均增加（Z分別為-2.572，-2.176；P＜0.05）。

FI組、FT組屬水平上，對相對豐度前100的菌屬進行兩組間的統計檢驗，篩選出7 種差異細菌。unidentified_Cyanobacteria相對豐度分別為0.007 103（0.002 597，0.009 856）、0.001 916（0.001 359，0.002 728），Pseudomonas相對豐度分別為0.001 384（0.000 614，0.003 441）、0.000 532（0.000 429，0.000 791），Catellicoccus相對豐度分別為0.000 156（0.000 039，0.000 341）、0.000 000（0.000 000，0.000 043），unidentified_Lachnospiraceae相對豐度分別為0.034 384（0.008 993，0.046 156）、0.012 013（0.006 059，0.021 563），Massilia相對豐度分別為0.000 319（0.000 124，0.000 983）、0.000 085（0.000 046，0.000 099），Cellulomonas相對豐度分別為0.000 057（0.000 014，0.000 170）、0.000 000（0.000 000，0.000 000），Oceanobacter相對豐度分別為0.000 000（0.000 000，0.000 004）、0.000 050（0.000 011，0.000 078）。與FT 組比較，FI 組腸道unidentified_Cyanobacteria、Pseudomonas、Catellicoccus、unidentified_Lachnospiraceae、Massilia和Cellulomonas相對豐度升高，Oceanobacter相對豐度降低（Z分別為-2.572，-2.205，-2.233，-2.347，-2.728，-2.770，-2.053；P均＜0.05）。

3 討論

健康人的腸道中有超過1014個的細菌數量，菌群種類在1 000種以上，腸道細菌數量和菌群種類保持一定的動態平衡，有利于維持機體健康，同時腸道菌群也被譽為人類“隱形的器官”［11］。腸道菌群失衡會導致炎癥性腸病、代謝綜合征、神經認知發育異常等疾病。近年來提出的“重視生命階段早期的菌群特征”并在疾病早期進行干預，也是腸道微生態研究的重要方向。

早產兒作為特殊的群體，受出生胎齡、出生體質量、出生后喂養情況、抗生素應用等多因素影響，存在菌群定植能力低下、腸道菌群屏障構建遲滯、多樣性下降等問題［12］。近年來隨著新生兒重癥監護病房呼吸、營養等支持條件的進步，極早產兒的存活率顯著提高，但同時也漸漸顯露出許多臨床問題，由于胎齡＜32 周早產兒平滑肌發育不成熟、胃腸道激素分泌和消化酶活性差等原因，出現FI 的極早產兒消化系統問題則更為突出［4］，一旦出現菌群結構失調，可能會導致如壞死性小腸結腸炎的發生，甚至敗血癥、過敏性疾病以及代謝性疾病等其他腸外系統疾病的發生。極早產兒除胎齡因素外，FI 也一直是臨床醫生關注的方面，盡管腸道菌群與FI 的關系在國內外的許多研究中得到肯定，但關于極早產兒群體的研究卻很少。為此，我們選取2018 年1 月—2019 年12月在廣州市第一人民醫院住院的早產兒為研究對象。根據極早產兒和FT/不耐受的標準入組，將極早產兒分為FT 組和FI組。為高效、快速、全面分FT極早產兒和FI極早產兒的菌群特征，本研究采取Illumina 高通量測序技術，基于16S rDNA 的微生物群落分析原則，對極早產兒出生后24 h 內胎糞中的微生物物種進行分析，估算其微生物種的多樣性、豐度和物種構成，進而探索FI 極早產兒出生菌群的特征并獲得以下發現：FI極早產兒腸道菌群多樣性較FT極早產兒顯著升高，且Cyanobacteria門、Acidobacteria門、Verrucomicrobia門、Chloroflexi門、unidentified_Cyanobacteria科、unidentified_Cyanobacteria屬、Pseudomonas屬、Catellicoccus屬、unidentified_Lachnospiraceae屬、Massilia屬和Cellulomonas屬在FI 組中顯著富集，并且在門水平和科水平，非優勢菌門/科（Others）在FI 組顯著增加，提示FI 極早產兒腸道菌群多樣性的增加可能與條件致病菌/非常駐菌的相對豐度顯著增加有關。

極早產兒出生胎齡小，腸道菌群未發育成熟，尤其是常駐的優勢菌增殖能力不健全，并且剖腹產患兒，在相對無菌的出生條件中原駐菌豐度較經陰道分娩低，伴隨出生存在的致病因素，條件致病菌豐度可能會增加。其中Cyanobacteria競爭性抑制其他常駐菌能力強，在無氧條件下能較好生長，并且破壞腸腔內無氧/微氧條件，可能與極早產兒消化道癥狀有關。Cyanobacteria產生的β-甲基氨基-1-丙氨酸及其最常見的結構異構體2，4-二氨基丁酸和N-2-氨基乙基甘氨酸能夠引起腸神經功能紊亂；Pseudomonas則是臨床中常見的新生兒宮內感染病原菌［13］，可以介導早產兒肺炎、眼部感染、咽峽炎、甚至敗血癥等多種感染［14-16］；Massilia是與感染性角膜炎、中耳炎有關的條件致病菌［17-18］；Cellulomonas則是近年來新發現的與敗血癥、感染性心內膜炎、膽管炎發生相關的致病菌［19-20］；Lachnospiraceae是人類腸道菌群中富集菌科，與短鏈脂肪酸的產生有關，可以為腸上皮提供能量，同時影響Treg/Th17 比值，介導腸道免疫反應［21-22］。此外，本研究中還發現了Catellicoccus和Oceanobacter兩種報導較少的海洋菌，人類疾病的研究極少，二者在早產兒FT情況中的研究仍需進一步探索。

基于我們的研究，FI 極早產兒的腸道菌群特征有其特殊性，既往研究［23］發現，FI 早產兒在未發生FI 前菌群多樣性個體差異較大，但大多提示FI 早產兒的多樣性下降，本研究中發現極早產兒的多樣性反而增高，可能是由于FI 極早產兒腸道菌群中致病菌相對豐度增加所致。FI 早產兒致病菌增多［如肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）］而Lactobacillus、Bifidobacterium等益生菌減少，并且克雷伯氏菌屬（Klebsiella）與FI 癥狀顯著相關，同時較大胎齡的早產兒在益生菌豐度下降方面比致病菌增加更顯著［24-25］。而本研究納入的極早產兒較以往早產兒菌群研究中的納入對象出生胎齡小，表現為Cyanobacteria門、Lachnospiraceae科、Cellulomonas屬、Pseudomonas屬、Massilia屬等條件致病菌或者介導腸道免疫反應的細菌顯著富集。由此可見，對于極早產兒臨床診療過程中，應該更關注條件致病菌的增加問題，極早產兒不同于較大胎齡的早產兒，其腸道菌群結構更薄弱，對于致病菌的抵抗力更低，對于極早產兒而言，在早期（出生時）應用抗生素和補充Lactobacillus、Bifidobacterium等益生菌更為迫切，因為Cyanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等細菌的繁殖能力強，對常駐菌的競爭性抑制作用強烈，更容易介導腸道菌群紊亂。此外，對于極早產兒糞便菌群的檢測，關注Cyanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等細菌的相對豐度，有利于預判FI的發生，及早進行配方奶、益生菌等干預。

但本研究系小樣本的研究，存在一定偏倚，且采集樣本的節點只有出生24 h 以內一個，無法動態分析極早產兒腸道菌群的變化及其與FT程度的關系。在后續的研究中完善大樣本的臨床數據調查和樣本分析，增加多個采集樣本的節點，深入致病菌的具體作用分子機制仍需不斷探索。

綜上所述，FI 的極早產兒出生時腸道菌群的多樣性下降，Cyanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等菌群富集明顯。Cyanobacteria、Cellu-lomonas、Pseudomonas、Massilia等條件致病菌的菌群變化可能是極早產兒出現FI 的原因。在臨床工作中需關注極早產兒腸道菌群建立的因素，特別是條件致病菌的影響，并且采取有效措施及早建立正常的腸道菌群，減少FI 的發生，同時及早運用抗生素、適當補充益生菌是重要的干預手段。