非病毒載體作用機制及在心血管疾病基因治療中的應用研究進展

徐建昌，王晞

1 武漢大學人民醫院心內科，武漢 430000；2 武漢大學心血管病研究所

基因治療是一種將外源的目的基因通過分子生物學技術轉運到受體靶細胞或者靶器官，糾正缺陷或異常的基因，達到治療疾病的目的。基因治療可用于腫瘤、遺傳病、感染性疾病、白血病、心血管疾病等疾病的治療中［1］。目的基因所帶的負電荷和大分子結構及機體生理的屏障作用，導致目的基因很難被轉運至靶細胞、靶器官，必須借助載體才能順利完成這一過程。選擇安全、高效、易制備的基因載體對心血管疾病的基因治療至關重要。基因載體可分為病毒載體和非病毒載體，目前臨床常用的病毒載體有逆轉錄病毒、腺病毒等，轉染效率較高［2］。但病毒載體具有免疫原性、細胞毒性、致癌、脫靶效應、價格昂貴、生產效率低等缺點，限制了其臨床應用［3］。非病毒載體是利用特殊材料的物理化學性質，并通過結構修飾和改造增加載體的功能，從而將外源核酸轉入到受體細胞，具有低免疫原性、高基因容量、安全、穩定和化學結構設計靈活多樣等優點，且非病毒載體可不受目的基因的分子大小限制，應用領域更加廣泛［4］。但非病毒載體的轉染效率不高，因此，開發安全、高效、易于生產的非病毒載體是目前的研究熱點。隨著人們對心血管疾病發病機制的深入研究及高分子篩選技術和分子生物學緊密結合，基因編輯在心血管領域的應用越來越廣，高效、安全的非病毒載體是心血管基因治療的關鍵。現將非病毒載體的作用機制、及其在心血管疾病基因治療中的應用最新研究進展綜述如下。

1 非病毒載體在基因治療中的作用機制

非病毒載體作為目的基因的載體具有很大優勢。首先，非病毒載體相對病毒載體而言更加安全；其次，非病毒載體易于合成，可大規模生產；另外，非病毒載體還可以通過結構修飾改變載體性質，提高載體轉染效率和細胞靶向性等。

非病毒載體在基因治療中的作用主要是將外源核酸遞送到受體靶細胞或者靶器官，其外源核酸主要包括：DNA、mRNA、siRNA、miRNA 以及反義寡核苷酸等。非病毒載體遞送DNA 進入細胞發揮功能時，需要穿過機體多種生理屏障，例如需避免在血液循環中被蛋白酶或者核酸內切酶降解、需穿透靶細胞膜及進入細胞質后避免被溶酶體溶解，最后還需跨越核膜屏障進入細胞核內。非病毒載體遞送不同類型核酸進入細胞途徑不同，例如非病毒載體在遞送mRNA 進入細胞過程中，從內涵體—溶酶體系統逃逸后無需進入細胞核，在細胞質中即可表達。非病毒載體遞送siRNA 過程和遞送mRNA 類似，但是siRNA 必須整合到RNA 誘導的沉默復合物（RISC）中才能發揮作用［5］。

為避免被核酸內切酶降解和機體免疫反應識別清除，非病毒載體需提前進行化學結構修飾，被修飾、改造的非病毒載體可以將外源核酸等大分子物質包裹在非病毒載體內部，提高非病毒載體水溶性，減少其在循環系統中被巨噬細胞吞噬。同時，非病毒載體還可以通過結構修飾或者在基本骨架上加上相關的配體，提高非病毒載體靶向性，減少脫靶效應。因為腫瘤細胞過度表達轉鐵蛋白受體，可以在非病毒載體上添加轉鐵蛋白配體，提高了非病毒載體靶向性，減少對正常細胞的破壞作用。CHOI 等［6］通過尾靜脈注射聚乙二醇化金納米粒子偶聯轉鐵蛋白（TF）觀察對s.c.neuro2A 腫瘤小鼠腫瘤靶向性的影響，結果顯示偶聯轉鐵蛋白的金納米粒子（聚乙二醇化金納米粒子偶聯轉鐵蛋白）遞送藥物到腫瘤細胞要明顯比未偶聯轉鐵蛋白的金納米粒子多，和非腫瘤細胞相比，腫瘤細胞中的藥物含量更多。PERRAULT等［7］對納米粒子尺寸和物理化學性質進行設計，以探究對腫瘤靶向性的影響，結果發現不同設計的納米粒子對腫瘤的生物特性及靶向性有很大的區別。甲氧基聚乙二醇（mPEG）修飾后的納米顆粒［8］可減少網狀內皮系統（RES）對納米顆粒的吸附作用和單噬細胞系統（MPS）對納米顆粒的清除，提高非病毒載體的轉染效率。

2 非病毒載體在心血管疾病基因治療中的應用

基因治療是一種很有發展前景的心血管疾病治療方法，安全可靠的非病毒載體是心血管疾病基因治療向臨床轉化的關鍵環節，因此，本文將介紹一些常見非病毒載體，根據物理和化學結構可以將非病毒載體載體分為脂質體、陽離子聚合物、金納米粒、多肽及蛋白質、殼聚糖等［9］。

2.1 脂質體在心血管疾病基因治療中的應用 脂質體是一種由脂質雙分子層組成的封閉囊泡，可遞送基因穿過細胞膜，脂質體主要有三部分結構構成：親水的頭部、疏水尾部和脂質連接體。陽離子脂質體與核酸帶陰離子的磷酸基團通過靜電相互作用緊密結合，形成脂質體—核酸復合物，可防止核酸被血液中的核酸酶降解。

脂質體具有以下優點：無免疫原性、可生物降解，然而脂質體卻具有潛在細胞毒性，但是研究者可以通過結構修飾和改造來減少脂質體不良反應。例如在脂質體外修飾聚乙二醇（PEG）可以屏蔽脂質體表面正電荷，減少蛋白吸附，提高其在血液循環中的時間和穩定性。FISHER 等［10］將攜帶siRNA 的細胞穿透肽（CPPs）修飾的中性聚乙二醇化的脂質體通過注射的方法來治療心血管疾病，通過活/死雙重染色法來測定細胞毒性。使用定量聚合酶鏈反應法來測定基因沉默，結果顯示細胞穿透肽修飾的中性聚乙二醇的脂質體細胞毒性降低，轉染效率提高，這說明脂質體可以通過結構修飾，提高脂質體的性能。

目前各種新型的脂質體已經被用來改善載體的生物相容性、裝載能力以及轉染效率。近幾年來出現一種新的藥物遞送方式，通過使用磁脂質體裝載藥物來治療心血管疾病，磁脂質體［11］是由脂質體和磁性納米粒子（NPs）組成的，是一種潛在的生物材料，可應用于磁靶向藥物的傳遞、MRI等領域。脂質體通過減少蛋白吸附，保護NPs，防止被降解破壞。BERTRAND 等［12］通過使用地爾硫卓灌注大鼠，研究結果顯示，跨膜pH梯度的脂質體可以緩解地爾硫卓藥物不良反應。

2.2 陽離子聚合物在心血管疾病基因治療中的應用 陽離子多聚物是目前在基因治療領域應用最多的聚合物之一。在生理PH情況下，陽離子聚合物可以與核酸結合形成復合物，將核酸體積壓縮到很小，將其包裹在聚合物內部，防止被核酸酶降解。此外，陽離子聚合物所帶正電荷可以促進細胞內吞作用。

陽離子聚合物具有靈活易修飾的優點。通過PEG、透明質酸、靶向配體、氟化物等修飾，可以提高載體的循環穩定性。加入親水基團、疏水基團、可降解基團等可提高陽離子聚合體的性能，增加轉染效率、降低細胞毒性。LIU 等［13］將羧甲基殼聚糖（CMCS）和聚乙烯亞胺（PEI）發生酰胺化反應形成CMCS-PEI 聚合物，增加了聚合物的絡合能力，降低細胞毒性、提高轉染效率，并且對紅細胞聚集、形態以及凝血功能影響比較小，該聚合體可能是一種安全、有效的非病毒載體。MCGINN 等［14］通過一種新型的生物可降解的多聚體將血管內皮生長因子（VEGF）轉入到骨骼肌成肌細胞中，再將骨骼肌成肌細胞注射到心肌梗死的區域，可以顯著促進心肌梗死區域血管重建，減輕心肌梗死范圍。

2.3 金納米粒在心血管疾病基因治療中的應用 金納米粒是一種無機納米材料，無機納米材料除了金納米粒外，還有石墨烯、碳納米管、量子點、磁性納米粒子等，其大小在1～100 nm 之間，能夠穩定吸附蛋白質，其大小、形態可控，可作為基因探針標記，對細胞多糖、蛋白質、激素等分子進行標記。

金納米粒子具有生物惰性、非細胞毒性、生物相容性、易于修飾改造等特性，因此非常適合作為核酸遞送載體，然而金納米粒子容易在生物介質中沉積造成組織損傷，限制了他們在醫學領域的應用，但是隨著科學技術的發展，已經開發出了廣泛封裝方法，可以提高金納米粒的水溶性，減少聚集。XU等［15］將無機納米粒子（NPS）或納米棒（NRS）封裝在氧化石墨烯納米片段中，成功構建了具有生物相容性親水外殼，然后在此基礎上加上亞胺（PEI），構建了一種新的基因載體（GOPEI-AuNPs），該基因載體轉染效率高，細胞毒性降低；TIAN 等［16］將聚乙二醇修飾的金納米粒作為遞送載體，結果發現，金納米粒主要聚集在梗死區域，可以減少心肌梗死范圍，提高心肌收縮力。

金納米粒還可用于動脈粥樣硬化的診斷。MELZER 等［17］采用金納米粒子負載巨噬細胞并結合流和圖像細胞技術方法，實現了對動脈粥樣硬化無創檢查。

2.4 多肽及蛋白質在心血管疾病基因治療中的應用 多肽及蛋白質可通過受體—配體反應實現目的基因的定向轉運，因此具有高度特異性和靶向性，多肽、蛋白質的非病毒載體可以根據功能分為以下幾類：熒光免疫標記的非病毒載體、靶向的非病毒載體、核定位的非病毒載體以及具有溶酶體逃逸的多肽的非病毒載體等［9］。

細胞穿透肽（CPPs）是一種陽離子多肽，可以獨立通過細胞膜轉運，運輸蛋白質、納米顆粒和寡核苷酸等物質，是一種很有前途的非病毒傳遞載體。LEHTO 等［18］通過對CPPs 修飾的非病毒載體遞送核酸的效率進行研究，發現細胞穿透肽的活性決定了非病毒載體從溶酶體逃逸的能力，結果表明細胞穿透肽修飾的非病毒載體能夠有效遞送外源核酸。

siRNA 是一種調節基因表達的非編碼RNA，已被評估為治療高血壓、動脈粥樣硬化及心力衰竭等心血管疾病的潛在治療靶點。研究者［19］將原代心肌細胞靶向肽和細胞穿透肽（TAT）整合到siRNA中，再與生物可降解的聚合物（CBA-DAH）結合，形成致密穩定的納米多聚體，該多聚體可以提高心肌細胞對siRNA 的細胞攝取并且增強基因沉默能力，而免疫原性和細胞毒性很低。

利用蛋白質特定功能也能實現核酸的高效遞送。YIGIT 等［20］通過拖絲重組蛋白來遞送DNA，并利用質子海綿內小體逃逸方法增強外源核酸傳遞，在COS-7 細胞系中，與聚乙烯亞胺（PEI）相比，轉染效率和細胞活力均提高；還有研究顯示外源DNA 分子可以通過結合核內定位信號肽（NLS），能夠順利通過細胞核核膜［21］。

基于多肽、蛋白的非病毒載體可以有效提高轉染效率、細胞靶向性，減少細胞毒性。HAMZAH等［22］發現LYP-1多肽可以通過超順磁性氧化鐵納米顆粒轉運到動脈粥樣硬化斑塊中，通過熒光標記發現LYP-1多肽修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒在動脈粥樣硬化高度表達。

2.5 殼聚糖在心血管疾病基因治療中的應用 殼聚糖［23］是一種由甲殼素的組成線性堿性多糖，殼聚糖具有穩定性、生物降解性和生物相容性等優點，還可以通過結構修飾、改造，使其轉染更加安全、高效，殼聚糖還可廣泛用于制備納米顆粒（NPs），納米顆粒可包裹siRNA、miRNA 等非編碼RNA，從而增強siRNA 在基因沉默中的功效、提高miRNA 的轉染效率。

基于RNA 干擾（RNAi）治療是一種非常有前途的心血管疾病治療方法。RNAi 被認為是一種高度特異性的基因沉默方法，通過降解靶向mRNA，敲除基因表達從而導致特定基因沉默，該機制由雙鏈RNA（dsRNA）介導，dsRNA 在Dicer 酶剪切下形成小干擾RNA（siRNA），然后將siRNA 摻入到RNA 誘導的沉默復合物中，從而識別并切割靶mRNA，在治療心血管疾病，病毒感染和癌癥等疾病方面具有巨大的潛力［24］。同時，miRNA 是一種潛在的心血管疾病診斷的檢測指標和治療靶點［25］，NGUYEN 等［26］通過殼聚糖納米顆粒傳遞miRNA 調節巨噬細胞內膽固醇，減少膽固醇外流。在心肌梗死治療過程中，YANG 等［27］通過水凝膠局部注射給藥的方法，將攜帶miRNA（MINPS）的聚合物納米粒子注射到心肌組織，結果顯示MINPS 可刺激人胚胎干細胞來源的心肌細胞和內皮細胞增殖，促進血管生成，顯著改善心肌梗死大鼠的心功能，實驗結果表明水凝膠/MINP 復合材料可以高效、安全地運送miRNA 修復受損心肌、減少心肌梗死。近年來有研究者［28］通過三甲基殼聚糖（TMC）-g-聚乙二醇（PEG）-REDV（短肽Arg-Glu-Asp-Val）遞送miRNA 到血管內皮細胞，明顯改善缺血組織壞死，該載體具有低細胞毒性，高轉染效率。

綜上所述，在心血管疾病基因治療過程中，有效、安全的載體是基因療法向臨床轉化的關鍵，非病毒載體可能是心血管疾病基因治療的關鍵，化學修飾后非病毒載體可將外源核酸遞送到受體靶細胞或者靶器官中，且載體轉染效率、細胞靶向性均較高。隨著材料化學和醫學研究的快速發展，非病毒載體種類將會越來越豐富，功能也越來越多樣，目前臨床常見的非病毒載體主要有脂質體、陽離子聚合物及金納米粒等。根據心血管疾病基因治療的特定需求，可以開發設計特定的非病毒載體，非病毒載體可通過遞送非編碼RNA參與心血管疾病的基因治療中，并隨著心血管疾病發病機制的深入研究，在未來將會出現越來越多的心血管疾病基因治療的潛在靶點。