鼠精原干細胞分離鑒定方法的應用及體外培養(yǎng)體系研究進展

陳琰，李興元，胡文慧，姚金玲，孔德營

遵義醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學教研室，貴州遵義563000

精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是雄性哺乳動物體內(nèi)惟一可以將遺傳信息傳遞給下一代的成體干細胞。SSCs 存在于曲細精管基膜上，可不斷自我更新，在成年雄性睪丸中可分化為精母細胞。SSCs 分化而來的精母細胞進一步分化為精子，從而將遺傳信息傳遞給子代。SSCs 的分離與體外培養(yǎng)對生殖醫(yī)學及動物分子育種具有重要的意義。SSCs 具有永生和多能的特征，是精子的前體細胞。通過體內(nèi)獲取精原干細胞，再以顯微注射技術(shù)將精原干細胞移植到受體的睪丸網(wǎng)當中，使移植的SSCs在受體睪丸內(nèi)不斷增殖、分化并形成精子是目前臨床治療男性不育癥的重要方法之一。隨著體外研究的不斷深入，SSCs 的形態(tài)功能特征、生理生化特性、細胞移植技術(shù)及其在精子發(fā)生中的調(diào)控機制也逐漸清晰，為SSCs 應用于各種體內(nèi)外因素，如內(nèi)分泌紊亂、化學污染、以及因青春期前淋巴瘤或白血病等接受全身大劑量化療后導致的無精或少精性不育癥的臨床治療，以及在制備轉(zhuǎn)基因動物和保護瀕危物種等方面的應用提供了理論依據(jù)［1］。本文主要對小鼠、大鼠這兩種實驗研究中最常用的模型動物中SSCs 分離鑒定方法的應用與體外培養(yǎng)體系最新研究進展綜述如下。

1 鼠SSCs分離方法的應用

SSCs 存在于雄性動物的各個年齡階段，即可隨時從雄性動物體內(nèi)分離出SSCs。在動物出生后的生長發(fā)育過程中，SSCs 會不斷的分化增殖為各級生精細胞。因此，隨年齡增長，精原干細胞在生殖細胞中的占比將逐漸減少。研究［2］表明，新出生的小鼠睪丸組織中SSCs 所占比例可以達到1.41%，而成年小鼠睪丸組織中SSCs 所占比例大幅下降，只有0.02%～0.03%。目前，我們在實驗過程中一般選擇出生第4～8 天的小鼠［3］或者出生第9 天的大鼠［4］為研究對象分離SSCs。

MEISTRICH 等［5］采用胰蛋白酶結(jié)合DNaseⅠ對小鼠SSCs 進行分離，得到的SSCs 純度較低，這種分離方法稱為一步分離法。后來SSCs的分離方法發(fā)展成兩步法。即首先用機械方法剪碎睪丸組織，然后用膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNase等3種酶對碎組織進行處理，獲得單細胞懸液，再通過純化處理，獲得精原干細胞。其中常用的純化方法有差速貼壁法、密度梯度法、免疫磁珠分選法以及流式細胞分選法等。

1.1 差速貼壁法在SSCs 分離中的應用 經(jīng)機械方法及酶消化分離法得到的SSCs 懸液中混雜著支持細胞。精原干細胞和支持細胞在經(jīng)過明膠處理的培養(yǎng)皿中貼壁速度不同，差速貼壁法就是利用此原理對SSCs 進行純化首先用飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)液重懸分離得到的細胞并計數(shù)，然后將細胞懸液移至明膠包被的培養(yǎng)皿，于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。因支持細胞貼壁速度快于SSCs，大部分支持細胞在短時間內(nèi)即可完成貼壁，而SSCs 在短時間內(nèi)尚未貼壁或貼壁不牢，所以在培養(yǎng)一定時間后，輕輕吹打細胞，將未貼壁的細胞移至新的明膠包被的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。在相同的條件下，再重復一次上述操作，吸出上層細胞懸液離心得到SSCs。然后用SSCs培養(yǎng)液重懸離心后的細胞并移至新的明膠包被的培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)。次日將含有未貼壁細胞的培養(yǎng)液移至鋪有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

差速貼壁法對實驗條件無特殊要求，操作簡單易行，因而常用于大鼠、小鼠等實驗動物SSCs 的純化。王慶鐘等［6］利用差速貼壁法分離純化大鼠SSCs，并后期體外培養(yǎng)成功，建立起大鼠SSCs 的分離、篩選、培養(yǎng)體系。同時，應用差速貼壁法也同樣適用于小鼠SSCs 的分離純化。凡志國等［7］通過4 次重復的差速貼壁法獲得純度達70%以上的SSCs。

1.2 Percoll 密度梯度離心法在SSCs 分離中的應用 Percoll 是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮（PVP）處理的硅膠顆粒，具有滲透性低、不穿透細胞、粘度小、密度大和無毒害等特點。首先需要配制濃度遞減的Percoll 分離液，將其依次加入離心管中，再將待分離的細胞懸液置于最上層，離心后用注射器將目的細胞帶移至事先做好標記的離心管中，最后再將目的細胞條帶離心、重懸，從而收集到較高純度的SSCs。該方法操作簡單易行，但單純使用這種方法得到的SSCs 純度相對較低。目前研究者們通常將該法與差速貼壁法聯(lián)合應用，從而得到純度更高的SSCs。王翠玲等［8］分離得到小鼠SSCs 后，先后采用密度梯度法和差速貼壁法對其純化，最終獲得的SSCs 純度高達64.42%。王永彬等［9］通過percoll 法初步分選SSCs，然后再利用差速貼壁法進一步分選純化SSCs，最終得到純度高達87%的小鼠SSCs。

1.3 免疫磁珠分選法在SSCs 分離中的應用 免疫磁珠是與特異性的抗體結(jié)合的超順磁性顆粒（即帶有磁力的抗體），直徑只有50 nm 左右，可與細胞表面的特定抗原結(jié)合，免疫磁珠的這種特性非常適用于SSCs的分離。使用免疫磁珠分選法提取SSCs時，首先需將經(jīng)酶消化得到的睪丸細胞懸液與免疫磁珠混合孵育，然后置于磁場中，其中被磁珠吸附的SSCs 經(jīng)buffer 重懸培養(yǎng)，而未被磁珠吸附的細胞懸液（主要含支持細胞）可丟棄或作為飼養(yǎng)層細胞。利用該方法可以獲得較高純度的SSCs。KUBOTA 等［10］通過胸腺細胞抗原1（thymus cell antigen 1，THY1）抗體耦聯(lián)磁珠對小鼠SSCs 進行純化處理時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Thy-1 微珠可使成年小鼠SSCs 的富集程度提高30 倍，說明免疫磁珠分選法是目前分離SSCs較為高效的方法。

1.4 流式細胞分選法在SSCs 分離中的應用 流式細胞分選法是將SSCs 的特異性標識分子與免疫熒光抗體結(jié)合，而后熒光信號被轉(zhuǎn)換為電信號，通過流式細胞分選儀分選出帶有熒光信號的細胞，從而較精確地獲得較高純度SSCs 的方法。劉建兵等［11］先用percoll 法分離睪丸細胞，然后通過流式細胞富集THY1 陽性的精原干細胞，得到細胞純度達到80.4%的SSCs。HAMRA 等［12］用流式細胞分選法則獲得了純度約90%的大鼠SSCs。由于流式細胞分選法在實際應用時對實驗條件及操作要求較高，因此實驗的重復性較差。

2 鼠SSCs鑒定方法的應用

SSCs 的鑒定主要是利用其特異性表面標志物，結(jié)合熒光定量PCR 法以及免疫組織化學法等進行。SSCs 的特異性表面標志物常見的有膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族受體α1（glial cell line derived neurotrophic factor family receptor alpha 1，GFRA1）、死盒解旋酶4（DEAD box helicase 4，DDX4）、鋅指和BTB 結(jié)構(gòu)域包含16（zinc finger and BTB domain containing 16，ZBTB16）等［13-14］，但SSCs 的特異性表面標志物只是相對特異，因為其表面標志物往往在睪丸的其他生精細胞中也有表達，只是在SSCs 上表達的量相對較多。

由于SSCs 同時具有干細胞的特性，因此也可以表達干細胞的特異性標記蛋白，如POU 結(jié)構(gòu)域，第5類、轉(zhuǎn)錄因子1（POU domain，class 5，transcription factor 1，POU5F1）和SRY（性別決定區(qū)Y）-框2［SRY（sex determining region Y）-box 2，SOX2］等［15］。根據(jù)SSCs 的這種特性，可通過多種表面標志分子共同標記的方法對其進行準確鑒定。

當體外培養(yǎng)的細胞同時表達生殖細胞標記蛋白，如GFRA1、DDX4、ZBTB16 等中的一種或多種以及多功能干細胞標記蛋白，如POU5F1 和SOX2 等中的一種或多種時，說明分離的細胞兼具生殖細胞和干細胞的特性，即可認定該細胞是SSCs。

3 鼠SSCs體外培養(yǎng)體系

在SSCs體外培養(yǎng)研究的初期，由于存在SSCs體內(nèi)含量低、培養(yǎng)體系不夠完善、離體后保持未分化狀態(tài)的時間較短以及特異標志物缺乏等條件的限制，使得最初的SSCs 體外培養(yǎng)研究具有分離純度低、培養(yǎng)時間短等特點。隨著SSCs 高效分離純化技術(shù)的出現(xiàn)以及體外培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化，大、小鼠SSCs體外培養(yǎng)技術(shù)已日趨成熟。SSCs 的體外培養(yǎng)體系最初不包含血清及飼養(yǎng)層。KANATSUSHINOHARA 等［16］于2008 年成功建立首個以粘連蛋白涂層為基礎(chǔ)，輔以血清和生長因子成分的小鼠SSCs 培養(yǎng)體系，該體系已成為目前人們從事SSCs 體外培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)。后來，研究人員發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)層細胞在SSCs的長期培養(yǎng)中至關(guān)重要，因此目前的SSCs體外培養(yǎng)體系中，飼養(yǎng)層細胞不可或缺，這也使得SSCs體外培養(yǎng)體系得到進一步完善。目前建立SSCs 體外培養(yǎng)體系的條件主要包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、適宜的溫度、飼養(yǎng)層細胞、血清及生長因子等。

3.1 培養(yǎng)基的選擇 不同實驗動物的SSCs 所處微觀環(huán)境不同，對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的要求也有一定的差異。目前常用的SSCs培養(yǎng)基主要有DMEM、MEM以及SFM 等［17］。在小鼠的SSCs 體外培養(yǎng)研究中，KANATU-SHINOHARA 等［18］使 用StemPro-34SFM 培 養(yǎng)基較為成功，該培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠SSCs 可達到6 個月之久。在大鼠SSCs 體外培養(yǎng)的研究中，HAMRA等［12］使用DMEM/F12培養(yǎng)基，使大鼠的SSCs在體外培養(yǎng)長達151 天，傳代12 次，細胞擴增了2 萬倍，且培養(yǎng)所得細胞的細胞活性保持較好。張仙玉等［19］通過實驗對比了DMEM/F12、DMEM（高糖）和Stem-Pro-34SFM 培養(yǎng)基的SSCs 培養(yǎng)效果，發(fā)現(xiàn)StemPro-34SFM 的培養(yǎng)效果優(yōu)于DMEM/F12 以及DMEM（高糖），可見StemPro-34SFM可能是目前大鼠SSCs培養(yǎng)基的最優(yōu)選擇。

3.2 飼養(yǎng)層的選擇 飼養(yǎng)層細胞可更好地延長SSCs 的體外培養(yǎng)時長。GUAN 等［19-20］在對小鼠的SSCs的體外培養(yǎng)研究中證明，沒有飼養(yǎng)層的SSCs 在培養(yǎng)7 d 后，細胞數(shù)會減少至初始狀態(tài)的10%～20%。這主要是因為飼養(yǎng)層細胞具有分泌生長因子，促進SSCs 的分裂增殖［21］并抑制細胞分化的功能。小鼠SSCs 常用的飼養(yǎng)層為小鼠成纖維細胞（SIM mouse embroy-derived thioguanine and ouabian resistant，STO）［20］、小鼠胎兒成纖維細胞（Mouse fetal fibroblasts，mEF）。張仙玉等［19］以mEF 細胞為飼養(yǎng)層使得精原干細胞能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)。飼養(yǎng)層細胞可能通過分泌堿性成纖維細胞生長因子2、轉(zhuǎn)化生長因子-β2 以及細胞外基質(zhì)蛋白等多種促生長因子，參與維持SSCs的穩(wěn)定體外培養(yǎng)。LIU 等［22-23］以人羊膜 上 皮 細 胞（Human amniotic epithelial cells，HAECs）和小鼠骨髓基質(zhì)細胞作為小鼠SSCs 飼養(yǎng)層細胞，也可實現(xiàn)了SSCs 的體外長期培養(yǎng)。而大鼠的SSCs 則更適合使用間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）作為飼養(yǎng)層進行培養(yǎng)［24］。

3.3 血清添加 血清在SSCs 的體外培養(yǎng)中，既有利于SSCs 的早期建系，又可減少細胞代謝產(chǎn)物的毒性作用，還可以為細胞提供營養(yǎng)。但血清也會產(chǎn)生一些不良作用，比如可導致SSCs 分化等。但總體而言，血清在SSCs 的體外培養(yǎng)中是利大于弊的［20］。孫源等［25］在小鼠SSCs 培養(yǎng)體系的研究中，建立起無血清的培養(yǎng)體系，且SSCs 經(jīng)過15 次傳代培養(yǎng)，仍可保持不分化的狀態(tài)。GUAN 等［20］在小鼠SSCs 培養(yǎng)基中加入了胎牛血清，發(fā)現(xiàn)血清除了有利于SSCs 的克隆增殖外，還延長了其培養(yǎng)時長（113 d）。DOVERE等［26］在小鼠的SSCs 培養(yǎng)基中添加不同體積分數(shù)的血清，發(fā)現(xiàn)低含量的血清可促進SSCs 克隆，而高含量血清則無此效果。

3.4 生長因子的選擇 生長因子可以調(diào)控SSCs 的更新和分化，其作用效果與其在培養(yǎng)基中的濃度以及因子間的相互作用等因素有關(guān)［27］。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）等生長因子在不同的小鼠SSCs 培養(yǎng)體系中，分別發(fā)揮促進SSCs 增殖的作用［28］。KANATSUSHINOHARA 等［16］所構(gòu)建的小鼠SSCs 培養(yǎng)體系中，10 000 U/mL 的LIF 和100 ng/mL 的bFGF 可顯 著提高SSCs 的活性，而胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）EGF、以及GDNF 等生長因子則不具備促進SSCs 增殖的作用。索麗娟等［29］研究結(jié)果表明，1 000 U/mL 的LIF 和20 ng/mL 的GDNF聯(lián)合應用也可促進SSCs 的增殖。但也有研究持相反意見，一項小鼠SSCs的體外培養(yǎng)研究［7］中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)體系中只添加單個生長因子EGF 時對SSCs 的增殖作用最佳，相反，在培養(yǎng)體系中同時添加多種營養(yǎng)因子，并沒有達到促進SSCs增殖的效果。

3.5 環(huán)境溫度選擇 SSCs 體外培養(yǎng)的溫度一般采用體腔溫度，即37 ℃。由于動物的睪丸溫度低于體腔溫度，在體腔溫度下培養(yǎng)不利于生精細胞的生長。因此，體腔溫度有利于去除SSCs 之外的其他生精細胞。但李蓮軍等［30-31］研究發(fā)現(xiàn)，32 ℃～37 ℃的環(huán)境溫度適合小鼠SSCs的體外培養(yǎng)，但34 ℃環(huán)境溫度可促進SSCs 的增殖并維持其細胞活性。另有研究［32］發(fā)現(xiàn)，32 ℃更有利于A型大鼠SSCs的體外培養(yǎng)。

綜上所述，目前常用的鼠SSCs 的分離方法為兩步分離法，首先用機械方法剪碎睪丸組織，然后用膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNase 等3 種酶對碎組織進行處理，獲得單細胞懸液，機械分離和酶消化細胞后，采用差速貼壁法、密度梯度法、免疫磁珠分選法或流式細胞分選法等純化SSCs。SSCs 的鑒定主要采用熒光定量PCR 法和免疫組織化學法鑒定GFRA1、DDX4、鋅指和ZBTB16SSCs 等特異性標志物可的鑒定主要是以其特異性標志物。SSCs 的體外培養(yǎng)體系中基礎(chǔ)培養(yǎng)基和適宜的溫度是培養(yǎng)的必要條件，飼養(yǎng)層細胞、血清以及生長因子等也必不可少。目前研究已對SSCs 在睪丸中的增殖、分化機制有了較為清楚的認識，這使得SSCs在體外保存并通過器官培養(yǎng)將其誘導分化為精子成為可能。通過SSCs 體外培養(yǎng)并借助基因修飾技術(shù)進行男性不育癥的治療以及遺傳性疾病的生殖細胞基因治療將是該領(lǐng)域科研人員未來關(guān)注的重要方向。