帕金森病大鼠模型制作方法研究進展

陳子方，吳海妹，沈凡藝，譚慧，郭沛鑫，解宇環

云南中醫藥大學，昆明650500

帕金森病（PD）是一種多發于中老年的、最常見的神經退行性病變之一。PD 病因及機制極其復雜，目前多巴胺（DA）神經元變性壞死所導致的多巴胺分泌嚴重不足被認為是主要發病原因。PD 患者常可見神經元內α-突觸核蛋白（α-SYN）及路易小體的積聚。PD 的發病機制、新型治療方案及藥物等一直是該領域研究熱點，上述研究也推動了契合臨床的PD 模型研究。PD 的靈長類動物模型能較好模擬臨床癥狀，但花費較多，不利于前期的藥物篩選和實驗研究；而某些嚙齒類小動物如小鼠等由于其腦部體積較小，不易區分相關腦區，手術操作難度較大，針對特定腦區的研究存在局限性。PD 大鼠模型制作經濟實惠且能較好模擬臨床病變。本課題組前期研究也發現，在某些PD 模型如6-羥基多巴胺（6-OH?DA）所致的PD 模型復制過程中，大鼠的存活率和造模成功率明顯高于小鼠，且操作更為簡便。目前常用PD大鼠模型主要有有神經毒素誘導模型、脂多糖誘導模型、轉基因模型、基因敲除模型、蛋白酶體抑制劑誘導模型、乙型腦炎病毒所致模型等［1］。現就常用PD大鼠模型制作方法相關研究進展進行綜述。

1 神經毒素誘導的PD模型

1.1 6-OHDA 誘導的PD 模型 6-OHDA 可以引起線粒體融合蛋白的改變，干擾線粒體持續的融合、分裂和運動，干擾ATP 合成，最終導致DA 神經元死亡。6-OHDA 不能穿過血腦屏障，造模時需采用腦立體定位儀將6-OHDA 注射于特定腦區。有文獻報道，采用單側兩點法造模成功率高于一點法，其具體方法為：將麻醉后的大鼠固定于腦立體定位儀上，以0.2% 6-OHDA（溶于0.02% 抗壞血酸溶液，防止6-OHDA 氧化）注射到右側的黑質致密部位（SN），兩個注射點相對于前囟的內側、硬腦膜腹側的表面坐標如下：坐標1 為前囟后（PB）3.0 mm，中位右側（MRL）2.5 mm，腹側硬腦膜下（VD）8.6 mm；坐標2為PB 2.4 mm，MRL 2.7 mm，VD 8.6 mm。在注射6-OHDA 2 周后注射0.01% 阿樸嗎啡10 mL/kg 誘導大鼠旋轉行為，轉速超過7圈/min（Φ 35cm/輪）判定為造模成功［2］。

有研究發現，6-OHDA 可產生不穩定抑郁癥狀［3］，向Wistar 大鼠腦內定向注射6-OHDA，術后2周表現為蔗糖偏好增強，術后3 周出現明顯的抑郁癥狀，因此6-OHDA 可用于制作PD 伴急、慢性抑郁（PDD）模型。KAMINSKA 等［4］認為在大鼠內側前腦束注入高劑量6-OHDA（16 μg/4 μL）可誘發神經和行為學改變，較適用于建立晚期PDD 模型。邢紅霞等［5］在6-OHDA 所致PD 模型的基礎上，通過給予大鼠急性強迫游泳，制作PD 伴急性抑郁模型；通過慢性不可預見性的溫和應激制作PD伴慢性抑郁模型。研究發現，上述兩組模型無論動物行為學還是單胺類神經遞質變化都與PD模型差異不大，推測PDD的成模機制可能以內源性因素6-OHDA起主導作用。

1.2 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的PD 模型 MPTP 因其脂溶性可快速通過血腦屏障，其毒性機制與其在腦內生成活性物質甲基苯基吡啶離子（MPP+）、抑制線粒體復合物Ⅰ的活性并導致DA 神經元變性及凋亡有關。曾朝蓉等［6］對雄性SD 大鼠腹腔注射MPTP（30 mg/kg，7 d），結果顯示，大鼠運動功能減退，直接膽紅素水平降低，血紅蛋白、紅細胞、白細胞、中性粒細胞升高，中腦黑質出現病理變化。

1.3 魚藤酮誘導的PD模型 魚藤酮是線粒體復合物Ⅰ抑制劑，脂溶性高，易通過血腦屏障，且無需轉運即可進入DA 神經元。其毒性機制包括增強氧化應激、誘導α-SYN 積聚致使DJ-1 和Parkin 突變，導致線粒體和蛋白酶體功能障礙，最終引起DA 神經元凋亡。魚藤酮模型增強了DA 通路中的氧化應激和神經炎癥，能涵蓋PD 的大部分病理特征［7］。注射魚藤酮誘導大鼠PD模型的方式可分為皮下注射、腹腔注射、靜脈注射和紋狀體定位注射。

1.3.1 皮下注射 有文獻報道，在SD 大鼠頸后皮下注射魚藤酮（2 mg/kg，4 周），大鼠運動緩慢、次數減少，伴震顫、不穩定的步態，黑質致密部有明顯的α-SYN 積聚［8-9］；魚藤酮注射量在2 mg/kg 以上，大鼠體質量出現明顯下降，酪氨酸羥化酶（TH）免疫反應神經元數量顯著減少，且皮下注射2 mg/kg 魚藤酮有利于α-SYN形成。

1.3.2 腹腔注射 實驗表明，對大鼠連續腹腔注射魚藤酮（2 mg/kg、4周，或1.5 mg/kg、2月，或2.5 mg/kg、2 月），大鼠體質量減輕，紋狀體和前額葉皮層分泌的DA 減少，紋狀體TH 的免疫反應活性降低［10］。但也有學者［11］發現，對大鼠腹腔注射2 mg/（kg·d）的魚藤酮、5 d/周、連續6周，沒有導致大鼠運動障礙或黑質紋狀體DA 神經元病變，反而引起了以胃腸功能障礙為表現的非運動癥狀。

1.3.3 靜脈注射 對大鼠靜脈注射相對高劑量魚藤酮（10～18 mg/kg，7～9 d），大鼠出現運動障礙、紋狀體和蒼白球損傷；注射相對低劑量魚藤酮（2 mg/kg或2.5 mg/kg或3 mg/kg，21 d），大鼠出現運動遲緩，其中2 mg/kg 組并未顯示TH 免疫活性降低，但隨著魚藤酮劑量增加，24% 的大鼠出現TH 免疫活性降低［12］。靜脈注射操作簡便、藥效迅速，但也容易增加大鼠因臟器系統毒性死亡的概率。

1.3.4 紋狀體注射 有研究者將魚藤酮溶解在DMSO、聚氧乙烯蓖麻油和生理鹽水的混合溶劑中，以三點分別定向注射4 μg/2 μL 的魚藤酮溶液到雄性SD大鼠右側紋狀體，發現該模型使大鼠紋狀體和黑質中TH 免疫活性降低，且能保持大鼠100% 的存活率［13］。

2 脂多糖（LPS）誘導的PD模型

LPS 是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是重要的內毒素。LPS 不能透過血腦屏障，通過腦內定位注射而誘導的神經炎癥可以復制PD的部分特征，包括小膠質細胞過度激活引起的機體炎癥反應及黑質紋狀體系統DA神經元的選擇性損傷。

2.1 黑質內注射 黑質區域定位注射LPS 可特異性地激活黑質區域的小膠質細胞，排除因其他神經退行性疾病所致小膠質細胞激活帶來的干擾［14］。HERRERA 等［15］通過立體定位注射2.0 μL 的LPS 至Wistar 雄性大鼠的黑質，發現大鼠TH 免疫活性降低，DA神經元受損，且損害不可逆。

2.2 注射至蒼白球 實驗證明，將LPS（10 μg/4 μL）注射到大鼠蒼白球兩坐標，大鼠出現黑質紋狀體系統中TH 陽性神經元減少、小膠質細胞持續激活、黑質中α-SYN 積聚增強等病理變化，其變化程度隨著大鼠年齡的增長更顯著，側面論證了老齡化是PD誘因之一的觀點［16-17］。

2.3 紋狀體內注射 有學者將LPS 分4 個坐標（3μL/坐標）注射到雄性SD 大鼠右側紋狀體，實驗結果顯示，大鼠黑質內DA 神經元減少，神經元內α-SYN和泛素蛋白積聚，大鼠出現行為學障礙［18］。

2.4 腦室內注射 李軍泉等［19］在雄性SD大鼠前囟后0.8 mm、旁開1.3 mm、硬膜下3.5 mm 處，立體定位分別向腦室內注射LPS 10、25、50 μg，發現腦室內炎癥反應促使黑質部位小膠質細胞被廣泛激活，且至24 周仍呈現 不同程 度 的激活。ZHOU 等［20］將25 μg LPS 立體定向注射到SD 大鼠右側腦室，結果表明，LPS 注射到側腦室內相較于注射到黑質致密部位（SN）或紋狀體內局部區域，能更好地模擬PD的進行性病變過程。

3 轉基因PD模型和基因敲除PD模型

PD 以散發性為主，約10%～15% 呈家族性。PD遺傳基因相關研究顯示，至少有20個位點和15個致病基因與家族性和散發性PD相關［21］。提示PD存在潛在的基因治療靶點。隨著哺乳動物基因組工程和技術的發展以及病毒表達載體的優化，能夠運用的PD 轉基因大鼠模型和基因敲除大鼠模型也逐漸增多。雖然使大鼠誘發基因突變的難度大于小鼠，且無法完全復制人類疾病的各種特征，但大鼠模型能更好地再現PD 的典型特征，包括黑質DA 神經元的進行性損害、局部運動行為缺陷和年齡依賴性的α-SYN異常積聚，其中以α-SYN異常積聚最為明顯［22］。因此，轉基因或基因敲除大鼠模型可能有更大的研究價值。

3.1 轉基因PD模型

3.1.1 LRRK2轉基因模型 LRRK2是位于細胞膜上的多結構域蛋白。攜帶LRRK2 基因突變者發展為PD的可能性隨著年齡的增長而增高。尸檢發現，大多數LRRK2 突變的PD 患者腦內有α-SYN 包涵體，表明LRRK2與α-SYN 所致PD 發病有共同機制。有研究將不同量的純化LRRK2p.G2019S 稀釋于微量注射緩沖液后注入SD大鼠受精卵的原核中，培育出的雄性BACLRRK2 p.G2019S 大鼠出生后3、6、12月運動能力逐漸降低，但12 月齡時紋狀體DA 功能無異常，TH 表達也無明顯變化，推測LRRK2 突變可能是PD發病原因的一部分，可能需要其他基因或環境共同作用，包括神經變性、DA 分泌減少在內的PD典型特征可能發生在晚期［23］。研究者認為，雖然上述LRRK2p.G2019S 大鼠沒有成為典型的PD 模型，但它們仍然是研究LRRK2 相關神經生物學病變的有用資源［24］。相反的，另有研究者把人LRRK2R1441G基因注入到SD 大鼠受精卵的原核中，大鼠出生后3、6、9、12 月均表現出PD 相關的運動缺陷；大鼠12月齡時給予腹腔注射百草枯2 次，至16 月齡才出現明顯的運動缺陷，且沒有表現出受百草枯影響的傾向，故研究者認為轉基因LRRK2R1441GBAC 大鼠不是PD的可行模型［25］。

3.1.2 α-SYN 轉基因模型 α-SYN 與PD 發病密切相關，α-SYN 通常以無結構狀態存在于突觸前膜，具有調節突觸可塑性、整合突觸前信號等功能。α-SYN 突變是常染色體顯性遺傳PD 的罕見形式，目前已發現3 種突變形式，包括A30P、A53T、E46K。突變的α-SYN 容易產生錯誤折疊，進而可引起細胞損傷。有學者［26］在Wistar大鼠黑質部位注射攜帶A53Tα-SYN 的重組腺相關病毒的載體溶液3 μL，21 d 后觀察到大鼠出現明顯運動障礙；28 d 后發現大鼠注射部位對側（左）前爪使用率降低了50%；32 d后PET成像觀察到多巴胺轉運體結合率降低85%，免疫組化顯示黑質中α-SYN 陽性聚集體形成。另有實驗利用腺相關病毒作為載體，將α-SYN基因遞送至雄性SD大鼠黑質區，13周后經皮下植入滲透性微型泵，并連續注入魚藤酮4周，大鼠出現典型的PD 三聯征（進行性運動功能障礙、黑質紋狀體神經變性、α-SYN 積聚），且受損神經元對魚藤酮更加敏感［27］。

3.2 基因敲除PD 模型 Parkin 是由PARK2 基因編碼的一種蛋白，具有E3 泛素連接酶功能，參與泛素蛋白水解酶系統，有助于維持細胞正常生命活動，在PD的氧化應激、線粒體損傷及蛋白酶體功能紊亂中也起到重要作用［28］。PINK1基因是第一個定位在線粒體上與PD 相關的基因，PINK1蛋白定位于線粒體膜的Ser/Thr 激酶，參與線粒體運輸、線粒體和蛋白酶體功能表達等過程，其正常表達可以減輕氧化應激對線粒體功能的損害和蛋白酶抑制劑所致的細胞凋亡。DJ-1 作為抗氧化劑和分子伴侶，在體內廣泛表達，其突變與常染色體隱性遺傳的早發PD 有關。DJ-1 可通過氧化應激使蛋白酶體降解系統紊亂，并能將胞質內蛋白移至線粒體，致使線粒體功能異常或降低。

DAVE 等［29］在4～5 周齡Long Evans Hooded 雌性大鼠體內注射20 U 的妊娠馬血清促性腺激素，48 h后注射50 U 人絨毛膜促性腺激素，立即與雄性大鼠交配，1 d 后得到受精卵；將ZFN mRNA 以10 ng/μL注射到受精卵原核中，受精卵植入雌鼠體內，產生第一代雜合鼠；篩選帶有所需基因的雜合鼠進行交配，最終得到純合子的Parkin、Pink1、DJ-1 基因敲除大鼠。與野生型（WT）大鼠進行比較，Pink1 敲除大鼠和DJ-1敲除大鼠從4月齡開始表現出明顯的運動缺陷，8 月齡時約50% 的DA 細胞喪失，出現黑質神經變性；而Parkin敲除大鼠沒有顯示出PD 相關病理表現。另外，Pink1 敲除大鼠和DJ-1 敲除大鼠不顯示臨床PD 表型的其他特征，腦區內無α-SYN 積聚，但仍能夠導致大鼠多巴胺能神經元變性［30-31］。

此外，還有學者用蛋白酶體抑制劑或乙型腦炎病毒誘導出PD 模型。張克忠等［32］將蛋白酶體抑制劑Lac tacystin 以兩點法立體定位注射到SD 雄性大鼠黑質部位，大鼠1周后出現運動障礙且逐步加重、TH 陽性細胞數明顯減少、α-SYN 表達明顯增加，該模型具有穩定、可重復、簡便易操作的特點，是目前認為比較接近PD 實際情況的模型。HAMAUE 等［33］將提取的乙型腦炎病毒株JaGAr-01 稀釋后加入MEM培養基內，并注入出生13 d的Fischer大鼠黑質區域，結果顯示黑質內TH 陽性DA 神經元數目明顯減少，大鼠出現運動遲緩癥狀，但該方法造模的可行性及穩定性有待進一步驗證。總之，目前用于科學研究的PD模型均存在一定局限性，并不能完全契合臨床的實際狀況。因此，在實際研究過程中，可采用多種模型結合、共同評價的方式進行。盡早構建出穩定、高度契合臨床的PD 模型，對PD 的發病機制、新型治療方案及藥物研究都至關重要。