介孔二氧化硅載體在酶蛋白固定化中的應用

董思圳，秦 風，賈文敬，李 歡，董宛阡，李 林，黃建忠，舒正玉

(福建師范大學生命科學學院 工業微生物發酵技術國家地方聯合工程研究中心，福建 福州 350108)

介孔材料是指孔徑介于2～50 nm之間的多孔材料，按其化學成分可分為介孔硅(如介孔SBA-15)、介孔金屬氧化物(如介孔氧化鐵，介孔氧化鉛)[1]、介孔金屬硫化物(如硫化鍺)[2]、介孔碳(如碳分子篩)[3]和介孔聚合物(如三嵌段共聚物FDU-15、FDU-16)[4]等。介孔材料表面可攜帶各種官能團，用于固定不同功能的活性分子。其中，介孔二氧化硅載體由于具有低毒、低成本、生物相容性好、化學惰性和熱穩定性優良等特點，被廣泛應用于藥物載體、酶載體等領域。近年來，不同形狀、孔徑、粒徑、比表面積、疏水性及攜帶多種功能基團的各種介孔二氧化硅載體相繼被制備出來，并表現出優良的性能。

綠色催化工藝被廣泛應用于生物質能源、手性藥物、可降解高分子材料合成等領域，催生了對各種固定化酶制劑的需求。為開發操作穩定性好、催化效率高的固定化酶制劑，科研工作者進行了大量的嘗試，選擇各種材料作為酶蛋白載體，包括早期的大孔樹脂、硅藻土到現在的各種納米材料等，其中，介孔二氧化硅是應用較為成功的載體之一。截至目前，介孔二氧化硅已成功應用于水解酶、氧化還原酶等酶蛋白的固定化，并展現出優良的催化性能。

1 介孔二氧化硅載體對酶蛋白的固定化效果

1.1 介孔二氧化硅固定化水解酶

包括脂肪酶(lipase,EC 3.1.1.3)、蛋白酶(protease,EC 3.4.21.112)、各種糖苷酶(EC 3.2.1.24)等在內的水解酶(hydrolase,EC 3)家族的酶蛋白，是最早成功應用于工業化催化生產、最早實現商業化制備的酶蛋白。水解酶能在生物柴油、燃料乙醇等生物質能源、手性藥物的綠色合成及精細化工等領域實現大規模的應用，并表現出優良的催化性能，其重要因素是各類固定化酶制劑的成功開發。Díaz 等[5]通過物理吸附首次將木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和細胞色素C固定在孔徑為4.0 nm的介孔二氧化硅MCM-41上。分子量較大的化合物，如聚-L-賴氨酸能顯著抑制游離胰蛋白酶水解N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-4-硝基苯胺的催化活性，殘留酶活僅為15%；但在相同條件下，固定化胰蛋白酶的殘留酶活高達68%。Jiang等[6]以單寧酸為造孔劑調整孔徑大小，制備了平均孔徑為(195±16) nm的介孔二氧化硅，并通過物理吸附固定伯克霍爾德菌脂肪酶Lip A，該固定化脂肪酶表現出良好的熱穩定性(70 ℃仍能保持90%以上的殘留酶活)和廣譜有機溶劑耐受性(對甲醇、乙醇、異辛烷、正己烷和四氫呋喃均表現出良好的耐受性)，能催化生物柴油的合成，轉化率可達到92%。Palanivelu等[7]利用介孔二氧化硅SBA-15吸附乙酰膽堿酯酶(AChE)后，進一步用戊二醛進行交聯，固定化乙酰膽堿酯酶作為生物傳感器用于檢測農藥殘留。結果表明，SBA-15固定化乙酰膽堿酯酶穩定性顯著提高，達到60 d以上。Sannino等[8]利用三乙氧基硅丙基異氰酸酯將β-葡萄糖苷酶共價錨定到介孔二氧化硅納米材料上，固定化β-葡萄糖苷酶較游離酶的熱穩定性提高了20 ℃。

為了方便固定化酶制劑的回收，越來越多的磁性介孔二氧化硅應用于水解酶的固定化。Poorakbar等[9]將纖維素酶共價固定到自制的磁性金介孔二氧化硅納米核殼(mAu@PSNs)上，通過紅外光譜證實了纖維素酶與mAu@PSNs成功結合，Bradford法測定蛋白質結合率為76%；以Whatman濾紙為底物，該固定化酶在9 h后仍能保持58%的初始活性。Ali等[10]制備了中孔(20～50 nm)介孔二氧化硅磁性材料，并用于固定皺褶假絲酵母脂肪酶，中孔介孔二氧化硅的載酶量可達797 mg·g-1，比活力高達1 503 U·g-1。

此外，一些高分子材料也被應用于介孔二氧化硅載體的修飾。?zbek等[11]通過原位聚合技術將丙烯酸和殼聚糖混合物包被介孔二氧化硅，制備出高分子聚合物包被的介孔二氧化硅納米材料，并成功應用于枯草桿菌蛋白酶的固定化。相對于游離酶，固定化蛋白酶的熱穩定性提高了10 ℃。Xiang等[12]制備了殼聚糖包被的介孔二氧化硅SBA-15復合材料，并用于固定豬胰脂肪酶，結果表明，相對于未用殼聚糖修飾的介孔二氧化硅SBA-15，復合材料的載酶量提高了20%，比活力提高了70%。

1.2 介孔二氧化硅固定化氧化還原酶

在高分子材料的綠色合成、環境污染物的生物降解、生物燃料電池的制造、醫學組織工程和生物傳感器的開發等領域，常常涉及到氧化還原酶介導的各種氧化還原反應。在利用介孔二氧化硅固定氧化還原酶的實例中，葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)和辣根過氧化物酶(EC 11.1.7)常作為模式氧化還原酶，以評價固定化效果。Pitzalis等[13]制備了有序介孔二氧化硅，并用于葡萄糖氧化酶/辣根過氧化物酶的共固定化。在該雙酶共固定化體系催化的偶聯反應中，氧化咖啡酸和阿魏酸的轉化率可達70%。Lei等[14]使用一種樹突狀介孔二氧化硅材料固定辣根過氧化物酶。與商用ELISA試劑盒相比，固定化辣根過氧化物酶的血清檢測靈敏度提高了2 000倍。Escuin等[15]使用一系列的介孔二氧化硅納米材料(SBA-15、SBA-3和MCM-48)固定多酚氧化酶。結果表明，所有固定化材料的載酶量均在pH值為4時達到最高(100 mg·g-1以上)，其中SBA-15更高達320 mg·g-1。

1.3 介孔二氧化硅固定化其它酶

除了水解酶和氧化還原酶，介孔二氧化硅也可作為其它酶蛋白的固定化載體。G?βl等[16]制備了一種大顆粒(直徑100 nm)中孔(7 nm)介孔二氧化硅，并應用于碳酸酐酶和辣根過氧化物酶的固定化。兩種固定化酶制劑分別催化2-甲氧基酚顯色反應和4-硝基苯乙酸酯水解反應，均表現出優良活性。Nara等[17]通過物理吸附將嗜熱地衣芽孢桿菌丙氨酸消旋酶固定到中孔(4.0～8.5 nm)介孔二氧化硅上，固定化酶表現出更高的熱穩定性(游離酶80 ℃下活性半衰期為20 min，固定化酶為60 min)和高效的重復利用性(重復使用5次后仍可保持50%的殘留酶活)。

2 影響介孔二氧化硅載體固定化酶蛋白效果的因素

2.1 孔徑與粒徑

介孔二氧化硅材料的基本性質是影響其固定化效果的關鍵因素，其中孔徑、粒徑、比表面積等因素對載酶量起決定性作用。通常認為，介孔二氧化硅載體的孔徑應稍大于酶蛋白的直徑。在相同孔徑的情況下，粒徑越大則越容易造成孔隙塌陷，粒徑越小則孔隙越少即孔隙率越低。一個理想的固定化酶介孔材料需要在載酶量、孔徑和孔隙率之間找到一個平衡點。Kalantari等[18]制備了可調節孔徑(1.6～13.0 nm)的介孔二氧化硅材料，并應用于固定假絲酵母脂肪酶，載酶量達711 mg·g-1；進一步研究發現，提高載體的疏水性，有助于提高固定化脂肪酶的催化活性。

2.2 有序介孔和無序介孔

有序介孔二氧化硅的制備主要利用特定類型的有機硅前驅體和結構導向劑(如兩親性表面活性劑和生物大分子)的自組裝。無序介孔材料的制備方法通常分為兩種：在有序介孔材料的孔隙中接枝功能基團或者在制備介孔材料時直接加入有機溶劑(如1,3,5-三甲苯)，以達到擴寬部分區域孔徑的目的。有序介孔材料簡單易制備，孔徑分布規則均勻適合單酶固定；無序介孔材料雖然復雜但可調節的因素更多，應用更加廣泛。Califano等[19]制備了一種中心徑向孔分層結構的介孔二氧化硅材料，并應用于固定β-葡萄糖苷酶，固定化β-葡萄糖苷酶顯著提高了酶對底物的親和性(游離酶km=5.4 mmol·L-1，固定化β-葡萄糖苷酶km=4.3 mmol·L-1)。Tahmasbi 等[20]先用四乙氧基硅烷(TEOS)和溴代十六烷基三甲胺(CTAB)制備了介孔二氧化硅，再用3-氨基丙基三乙氧基硅烷進行功能化修飾并接枝，最終獲得的介孔二氧化硅平均粒徑小于100 nm，并利用該材料固定脫氧核糖核酸酶、凝固酶和α-淀粉酶。結果表明，固定化酶具有抗革蘭氏陽性菌(枯草桿菌和金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和銅綠假單胞菌)的功能。

2.3 表面化學修飾

對介孔二氧化硅材料表面進行化學修飾，豐富載體表面基團的類型，有助于提高其作為固定化載體的載酶量，優化固定化酶制劑的性能。Harmoko等[21]制備了乙酰基修飾的介孔二氧化硅納米材料，并應用于纖維素酶的固定化，固定化纖維素酶的酶活提高了56倍。Gao等[22]制備了經多巴胺修飾的介孔二氧化硅納米材料，并應用于念珠菌脂肪酶的固定化，固定化念珠菌脂肪酶貯存30 d后，殘留酶活仍保持在64%。Ahmadi等[23]使用N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷對磁性介孔二氧化硅進行功能化修飾得到復合材料，用于固定α-淀粉酶，利用該固定化酶催化溴苯與苯硼酸的偶聯反應，轉化率提高至98%，且反應時間縮短至0.17 h。Mosafa 等[24]利用(3-氯丙基)三甲氧基硅烷修飾二氧化硅包裹的磁性納米粒子得到復合材料，用于固定木瓜蛋白酶。與游離酶相比，固定化木瓜蛋白酶在處理石榴汁濁度時重復使用8次后，殘留酶活仍保持在50%以上。

2.4 其它因素

影響介孔二氧化硅載體固定化酶蛋白效果的因素還包括pH值、造孔模板、制備工藝等。Díaz等[5]使用介孔二氧化硅MCM-41對球形酶、細胞色素C、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶進行固定化，發現pH值對載酶量具有顯著影響，pH<7時能顯著提高木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的載酶量；而pH>7時細胞色素C的載酶量顯著提高。Venezia等[25]以單寧酸為造孔劑制備了改性介孔二氧化硅，并用于固定β-葡萄糖苷酶。游離酶在60 ℃下僅保持55%活性，而固定化β-葡萄糖苷酶在60 ℃下仍保持100%活性。Dai等[26]以菠蘿皮羧甲基纖維素、聚乙二醇和介孔二氧化硅SBA-15為原料，采用反復凍融法制備了水凝膠復合材料，并用于固定木瓜蛋白酶。在80 ℃下孵育2 h后，固定化木瓜蛋白酶保留了56%的初始活性，而游離酶僅保留了16%的初始活性；貯存10 d后，固定化木瓜蛋白酶保留了79%的初始活性，而游離酶僅保留了27%的初始活性。

3 結語

隨著制備工藝的日趨成熟和完善，越來越多新型的介孔二氧化硅材料被開發出來。如Li等[27]開發了一種簡便、改進的雙相制備方法，通過調節表面活性劑和兩親性試劑的濃度及協同作用，可快速制備出孔徑(6.1～11.4 nm)大小可調控的、開放的核殼磁性介孔二氧化硅微球。同時，介孔二氧化硅材料表面修飾的化學基團種類也越來越多，其拓展的應用領域也必將越來越廣。

作為一種制備簡單、生物相容性和安全性良好、孔徑可控、比表面積大的多孔材料，介孔二氧化硅越來越廣泛地用作各種酶蛋白的固定化載體，并取得較好的應用效果。目前，介孔二氧化硅更多地應用于單酶固定化，隨著多酶偶聯催化反應的興起及廣泛應用，如何實現多種酶蛋白在介孔二氧化硅表面的有序組裝(或自組裝)依然存在挑戰。