膠質(zhì)瘤對替莫唑胺耐藥機制的研究進展

楊開，王春紅 ，成睿，吉宏明

1 山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，太原030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科

世界衛(wèi)生組織的中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤分級中，Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤，其中Ⅳ級為膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）［1］。由于膠質(zhì)瘤發(fā)病位置特殊，正常腦組織與腫瘤組織之間界限模糊，外科治療徹底清除病灶組織難度系數(shù)大，治療效果差且易復(fù)發(fā)，病死率極高［2］。臨床以手術(shù)切除腫瘤為主，術(shù)后替莫唑胺（TMZ）聯(lián)合同步放療已成為新診斷 GBM 的標(biāo)準治療方案［3］。GBM 多采用 TMZ 化療，低級別的膠質(zhì)瘤存在高危因素也推薦使用TMZ化療。TMZ 是一種新型的口服烷基化劑。隨著化療的進行，大多數(shù)患者最終會對TMZ 產(chǎn)生耐藥性。因此，迫切需要了解TMZ 耐藥機制。目前研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤對TMZ 耐藥的機制多樣，本文對其中大部分機制進行綜述。

1 DNA損傷修復(fù)參與的耐藥機制

1.1 O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT） 在 TMZ 引起的DNA 甲基化修飾中，O6-甲基鳥嘌呤修飾的毒性最大，在TMZ 誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細胞死亡中有重要作用。MGMT是一種由MGMT基因編碼的DNA 修復(fù)酶，TMZ 誘導(dǎo)的O6-甲基鳥嘌呤的DNA修飾可被MGMT逆轉(zhuǎn)，能去除DNA烷基化加合物，從而修復(fù)受損的DNA，促進膠質(zhì)瘤對TMZ 的耐藥性［5］。MGMT 的蛋白表達可被 MGMT 基因的啟動子甲基化表觀遺傳沉默，與疾病預(yù)后相關(guān)。MGMT啟動子甲基化狀態(tài)是預(yù)測GBM 預(yù)后的生物標(biāo)志物，但其在GBM患者治療中的價值仍存在爭議。

1.2 DNA 錯配修復(fù)（MMR） 如果在細胞分裂前未除去甲基，則會觸發(fā)MMR 途徑，MMR 修復(fù)了MGMT未修復(fù)的O6-甲基鳥嘌呤病變。子鏈上錯配胸腺嘧啶被MMR 主動識別并切除，但O6-甲基鳥嘌呤仍然存在于模板鏈中，之后胸腺嘧啶重新插入和切除的無效循環(huán)導(dǎo)致持續(xù)的DNA 鏈斷裂，從而導(dǎo)致復(fù)制叉塌陷，最終會導(dǎo)致細胞凋亡［6］。MMR 缺陷細胞無法切除新合成的子鏈，使腫瘤細胞繼續(xù)增殖，最終導(dǎo)致對TMZ 介導(dǎo)的細胞毒性產(chǎn)生抵抗。MutS 是MMR 系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的修復(fù)蛋白，MutS 突變會有助于TMZ治療膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)和耐藥。

1.3 堿基切除修復(fù)（BER） 活性氧、電離輻射和烷化劑等會導(dǎo)致細胞產(chǎn)生小片段的受損核苷酸、暴露的堿基位點以及導(dǎo)致DNA 單鏈斷裂，BER 是參與其去除和修復(fù)的主要途徑。TMZ 對N7-甲基鳥嘌呤的甲基化會立即被BER 途徑中的DNA 修復(fù)酶多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）修復(fù)，因此導(dǎo)致TMZ耐藥［7］。PARP抑制劑類藥物可用于對抗TMZ耐藥。

2 細胞信號通路異常介導(dǎo)的耐藥機制

2.1 p53 介導(dǎo)的信號通路 p53 是一種由TP53 基因編碼的腫瘤抑制蛋白，TMZ 治療膠質(zhì)瘤引起的一系列相關(guān)DNA 損傷反應(yīng)最終會激活p53，使p53 發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能。小鼠雙微體2 同源物（MDM2）是一種E3 泛素蛋白連接酶，其表達被蛋白激酶B（Akt）上調(diào)，Akt 在受體酪氨酸激酶（RTK）激活的下游發(fā)揮作用，進而負向調(diào)節(jié)p53蛋白的表達。p53 的直接基因改變或p53 與MDM2 蛋白之間的相互作用是p53 功能失活的兩種機制［8］。腫瘤抑制因子p14ARF 可競爭性的與MDM2 結(jié)合，阻斷p53 與MDM2 相互作用，從而上調(diào)p53 表達。腫瘤抑制酶張力蛋白同源物（PTEN）能抑制MDM2 轉(zhuǎn)錄使p53不被降解失活，同時也可以使TP53基因的轉(zhuǎn)錄活性增強，其突變導(dǎo)致腫瘤細胞增殖增強。PTEN 和p53的關(guān)聯(lián)可以增強腫瘤細胞對TMZ的敏感性［9］。半乳糖凝集素（Gal1）屬于凝集素家族，其表達會因缺氧刺激而增加，Gal1 能調(diào)節(jié)修飾p53 的生物學(xué)功能，Gal1 還可作用于Ras 相關(guān)通路，導(dǎo)致對化療的耐藥性［10］。以上均說明 p53-MDM2 軸在 DNA 損傷介導(dǎo)的耐藥中起作用，TP53 基因的突變導(dǎo)致促進腫瘤細胞生長和對TMZ 的抵抗，通路相關(guān)環(huán)節(jié)的抑制可能成為將來對抗耐藥的靶點。

2.2 活性氧（ROS）介導(dǎo)的信號通路 TMZ 通過過氧化物酶體、微粒體和線粒體氧化產(chǎn)生細胞內(nèi)ROS，其引發(fā)的DNA 雙鏈斷裂也會產(chǎn)生次級ROS。ROS會激活多個應(yīng)激反應(yīng)信號通路，還可直接或者間接損傷細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)的生理功能，是眾多疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)［11］。膠質(zhì)瘤細胞可能在ROS 產(chǎn)生過程中發(fā)揮作用，以保護TMZ 誘導(dǎo)的細胞死亡，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。當(dāng)TMZ 介導(dǎo)細胞死亡信號時，ROS 最初激活 c-JUN 氨基末端激酶（JNK），JNK活化可強效誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞中MGMT表達和樁蛋白活化，促進DNA 修復(fù)和膠質(zhì)瘤細胞的侵襲［11］。ROS 介導(dǎo)的信號通路，在TMZ 耐藥機制中占重要地位，相關(guān)藥物的聯(lián)用也在一定程度上提高了膠質(zhì)瘤治療的療效。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)信號通路 在經(jīng)典的靶向DNA 損傷外，TMZ 還引起脫靶效應(yīng)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERSR），調(diào)節(jié)GBM 化學(xué)敏感性。TMZ 介導(dǎo) ROS 產(chǎn)生也能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞 ERSR［12］。當(dāng)ERSR 被激活后，蛋白激酶R（PKR）樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）隨后被激活，PERK 被激活有助于促進膠質(zhì)瘤細胞的生長。在輕度ERSR 下，多種細胞保護作用可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對TMZ 的耐藥性。而在持續(xù)和嚴重的ERSR 下，細胞穩(wěn)態(tài)無法恢復(fù)，導(dǎo)致各種途徑的激活。ERSR 有一重要下游目標(biāo)，即自噬，其通過參與線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑的關(guān)鍵步驟，參與對關(guān)鍵蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)，而具有促腫瘤細胞生存的作用，為細胞提供代謝的底物，并使其對化療具有耐藥性［13］。在臨床治療中，抑制自噬可顯著增加TMZ導(dǎo)致的細胞凋亡。

2.4 RTK 相關(guān)信號通路 RTK 的致癌活化是維持膠質(zhì)瘤細胞致癌性的關(guān)鍵信號。在正常細胞中，RTK 結(jié)合胞外特異性配體，并在質(zhì)膜中自我二聚化，從而誘導(dǎo)RTK 的C 末端胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的自身磷酸化，磷酸化的RTK 激活下游各種細胞信號分子，誘導(dǎo)細胞增殖與侵襲［14］。磷酸酶對RTK 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)具有重要的調(diào)節(jié)作用，PTEN 通過抑制磷酸肌醇3-激酶（PI3K）影響下游信號。除PTEN 外，已知磷酸酶PP2A 通過去磷酸化阻斷Akt、ERK1/2和其他信號分子（如c-Myc），在調(diào)節(jié)RTK 介導(dǎo)的信號中發(fā)揮作用，PP2A 作為腫瘤抑制因子被廣泛認可［15］。膠質(zhì)瘤RTK 及其下游相關(guān)通路的異常激可導(dǎo)致其對TMZ 產(chǎn)生耐藥性。三條主要通路總結(jié)如下。

2.4.1 RTK-Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路 細胞外的信號刺激原癌基因Ras，使其與三磷酸鳥苷結(jié)合而激活，進而磷酸化激活Raf，之后Raf 再激活有絲分裂原激活蛋白激酶（MEK），MEK 經(jīng)磷酸化激活細胞信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK），最終驅(qū)動基因表達［16］。活化的ERK 催化許多胞質(zhì)效應(yīng)器和核轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而誘導(dǎo)細胞存活、遷移和增殖［17］。抑制該通路的異常激活，能有效抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，改善TMZ耐藥。

2.4.2 RTK-PI3K-Akt-mTOR 信號通路 PI3K 是活化的RTKs 磷酸化磷酸肌醇3-激酶，將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3在質(zhì)膜上招募3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）和蛋白激酶B（Akt），之后PDK1 磷酸化Akt，導(dǎo)致Akt 活化。磷酸化的Akt 激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）蛋白復(fù)合體，mTORC1蛋白復(fù)合體是控制能量和氧化還原反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子之一，對膠質(zhì)瘤細胞的致癌特性有積極貢獻［18］。此通路通過誘導(dǎo)腫瘤血管生成，誘導(dǎo)自噬以及參與腫瘤的增殖、遷移等，導(dǎo)致腫瘤細胞對TMZ耐藥。

2.4.3 酪氨酸激酶Janus 激酶（JAK）-轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路 RTK 活化后，JAK 發(fā)生酪氨酸磷酸化，將STAT 募集至RTK 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的磷酸酪氨酸殘基，酪氨酸磷酸化STAT，并通過與其他STAT形成同源二聚體或異源二聚體釋放到細胞質(zhì)中，寡聚化的STAT 被ERK1/2 進一步磷酸化，并穿梭到細胞核中，最終與靶基因的啟動子結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細胞增殖和遷移［19］。JAK 還與酪氨酸磷酸化的接頭蛋白結(jié)合，通過RTK 活化，激活Ras 介導(dǎo)的通路。在TMZ 耐藥的膠質(zhì)瘤中STAT3 活化增加，在這些膠質(zhì)瘤中靶向 STAT3 克服了 TMZ 耐藥［20］。膠質(zhì)瘤中STAT 的致癌激活可能主要由RTK 相關(guān)機制的過度激活觸發(fā)，并可能增加了膠質(zhì)瘤的治療難度。

2.5 轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）介導(dǎo)的信號通路 TGF-β 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)是膠質(zhì)瘤生物學(xué)方面重要調(diào)節(jié)機制之一。在健康細胞和早期癌細胞中，TGF-β 通路具有腫瘤抑制功能，包括促進細胞周期停滯和凋亡；而其在晚期癌癥中的激活可促進腫瘤發(fā)生，包括轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性。上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）可減少各種癌癥的細胞間黏附，與TMZ 耐藥性有關(guān)，可被 TGF-β 激活。TGF-β 信號傳導(dǎo)途徑是由 TGF-β 與 TGF-βRⅡ結(jié)合而引發(fā)的，后者會募集TGF-βRⅠ并使其磷酸化，隨后激活SMAD 信號通路，之后通過激活PI3K/AKT 和RAS/MAPK 通路獲得致癌性突變，從而選擇性地抵抗TGF-β 的細胞生長抑制作用或p53 途徑［21］。結(jié)締組織生長因子（CTGF）是屬于 CCN 家族的分泌蛋白質(zhì)。TGF-β 通過SMAD 和 ERK1/2 信號通路調(diào)控 CTGF；CTGF 通過促進抗凋亡生存蛋白和轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白的表達，或抑制促凋亡PARP 表達，賦予TMZ 抗藥性。靶向TGF-β/CTGF 信號軸可能為克服TMZ 耐藥提供新策略。

2.6 Wnt/β-Catenin 信號通路 Wnt 信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的不同階段發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并且其通路活化會導(dǎo)致TMZ 耐藥。LncRNA參與細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及化療耐藥。LncRNA-H19 在耐TMZ 的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中高表達，而 LncRNA-H19 沉默可通過 Wnt/β-Catenin 途徑抑制膠質(zhì)瘤細胞的EMT，從而降低其對TMZ 的化學(xué)耐藥性［22］。

3 膠質(zhì)瘤干細胞（GSC）參與的耐藥機制

GSC 可以自我更新、不斷分化、無限增殖，其被認為是膠質(zhì)瘤進展和耐藥性的原因之一。SOX9 是在大多數(shù)實體瘤中表達的轉(zhuǎn)錄因子，過表達SOX9可抑制細胞凋亡，且促進其增殖、侵襲和遷移；敲低GBM 細胞系中的SOX9 明顯抑制了干細胞樣特性，包括干細胞標(biāo)志物表達和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞球形成，表明 SOX9 會調(diào)節(jié) GSC 的自我更新［23］。丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）是 SOX9 的下游目標(biāo)，PDK1 的活性影響了GBM 中GSC 的自我更新，其失活抑制了膠質(zhì)瘤細胞球的形成，并極大地使膠質(zhì)瘤球?qū)MZ 敏感。磷酸化AKT 的水平受PDK1 活性的調(diào)節(jié)，這也對TMZ 的耐藥性有影響［24］。總之，SOX9-PDK1軸是GSC 自我更新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑，在TMZ 耐藥性中占有重要地位。

4 腫瘤微環(huán)境（TME）參與的耐藥機制

4.1 低氧微環(huán)境 低氧被認為是EMT 的主要特征，能通過多種機制來激活EMT 相關(guān)信號通路，例如上調(diào)EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、阻遏物表達；低氧條件下，NF-κB 和 Notch 直接觸發(fā) EMT 的信號傳導(dǎo)途徑也被激活，且低氧會增加ROS水平，從而通過TGF-β信號通路促進細胞增殖并誘導(dǎo)EMT［25］。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是與缺氧相關(guān)的最重要的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α 可促進GBM 在缺氧條件下的惡性進展，HIF靶向治療與TMZ 聯(lián)用減少了腫瘤的發(fā)生，并顯著提高了化療敏感性。HIF-1α/HIF-2α/miR210-3p 網(wǎng)絡(luò)通過與表皮生長因子的正反饋循環(huán)促進GBM 的惡性進展，還使分化后的GBM 細胞脫分化，產(chǎn)生GSC；敲除HIF可抑制細胞周期停滯，促進細胞增殖，進而促進GBM 的化療增敏［26］。可見低氧微環(huán)境會介導(dǎo)化療耐藥，這對GBM的治療具有重要意義。

4.2 外泌體（EXO） EXO 是一種囊泡，由機體釋放，內(nèi)部容納與供體細胞相關(guān)的蛋白質(zhì)以及核酸，可通過內(nèi)吞作用被細胞吸收。EXO 在促進腫瘤遷移、侵襲、血管生成和影響耐藥等方面有著重要的作用，并且能夠影響EMT。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞以非接觸方式刺激星形膠質(zhì)細胞進入反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞（RAS），其釋放的EXO 中MGMT mRNA 表達顯著增加。MGMT 陰性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞可攝取RAS EXO，并通過翻譯外源性EXO MGMT mRNA 獲得耐TMZ的表型。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SBF2-AS1 的表達在耐TMZ 的GBM 細胞和組織中被上調(diào)，GBM 細胞通過分泌富含此致癌物質(zhì)的EXO 來重塑EMT，從而促進腫瘤對 TMZ 的耐藥性［27］。針對 EXO 設(shè)計的靶向藥物或許會成為解決耐藥的重要手段。

5 表皮生長因子受體（EGFR）參與的耐藥機制

EGFR 是一種蛋白激酶，可促進腫瘤增長、進展侵襲、血管生成、化學(xué)耐藥等，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮巨大的作用。EGFR 與配體的結(jié)合能激活Ras/Raf/ERK 通路或 PI3K/AKT/mTOR 通路，引起細胞自噬和凋亡的抑制，造成TMZ 效率的下降。EGFR 表達的降低以及對其通路的抑制將會抵抗TMZ耐藥。

6 微小RNA（miRNA）參與的耐藥機制

miRNA 參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達調(diào)控，可作為一類新的癌基因或抑癌基因而發(fā)揮作用。近年來測序發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-195 等在耐藥細胞系中表達上調(diào)，而miR-145、miR-186 等在膠質(zhì)瘤耐藥細胞系中表達下調(diào)［6］。miRNA 種類繁多，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，miRNA的突變、異常表達會導(dǎo)致耐藥。

膠質(zhì)瘤對TMZ 耐藥的機制錯綜復(fù)雜，未發(fā)現(xiàn)的機制、治療中只對單一靶點的作用、全身給藥的策略以及各機制的補償作用等，導(dǎo)致解決TMZ 耐藥的結(jié)果并不理想。今后的研究還要著手于對未發(fā)現(xiàn)機制的探索以及治療策略的改進。