尿源性干細胞及其在軟骨與骨組織工程中的應用進展

李嘉，萬莎，田臻，林科夫，李浪

西藏自治區人民政府駐成都辦事處醫院骨科，成都610041

目前軟骨和骨缺損的修復依然是臨床中的一大難題，軟骨和骨損傷若未及時治療，缺損將持續增大，最終引起骨關節炎［1-2］。臨床上治療軟骨和骨缺損損傷的傳統手術方法主要有兩種，微骨折技術［3］，但手術有熱灼傷、軟骨下骨骨折等不良反應；軟骨或骨移植（自體或異體）［4-5］，自體移植物修復的效果良好，但會增加供區手術創傷和患者的痛苦，移植物供體來源有限，移植后有不同程度的宿主免疫排異反應，增加感染風險。組織工程學已經成為一種用于骨修復和再生的新療法。組織工程學旨在通過工程學、生物學原理和技術，以種子細胞和生長因子協同組合來誘導新的功能性骨再生。骨髓間充質干細胞（BMSC）、胚胎干細胞等被廣泛運用于軟骨與骨組織工程。然而，BMSC 需通過抽取骨髓獲得，胚胎干細胞的應用又受畸胎瘤形成風險和倫理學的困擾［6-9］。因此目前需尋求易獲得且豐富的干細胞來源。人尿源性干細胞（hUSC）是從尿液中得到的一種成體干細胞。在定向誘導下，可分化為骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。hUSC 具有來源廣泛、培養簡單的優點，這使hUSC 作為種子細胞在組織工程中應用具有強大潛力。目前關于hUSC 在軟骨與骨組織工程中的應用已有相關研究報道，現綜述如下。

1 hUSC概述

1.1 hUSC的來源及定向誘導分化 干細胞的形態一定程度上能夠代表其來源，因為細胞的形狀取決于細胞的性質。目前hUSC 主要有四種形態：米粒樣、紡錘樣、圓形及多角形，偶可見拉絲狀細胞。這些形態與之前報道的尿路上皮樣細胞具有相似的形態，說明hUSC有可能來源于尿路上皮細胞。

干細胞的表型鑒定主要通過流式細胞學檢測，目前多項研究表明hUSC 的表面標志物類似于MSC和外周細胞，而非造血干細胞。流式細胞學結果顯示，hUSC 表達 MSC 樣細胞表面標志物（SSEA-4、CD44、CD54、CD73、CD90、CD105、c-kit），很少表達CD133、CD31、CD34，幾乎不表達CD45；此外，超過90% 的 hUSC 表達外 周細胞標 志物（CD146）［10］，62.3%的hUSC 表達SSEA-4，表明其具有較強的干細胞潛能，同時CD34、CD45和c-kit均為陰性。這說明hUSC 是非造血細胞來源，只有不到3%的細胞表達免疫標志物（HLA-DR），提示其對同種異體移植的低免疫排斥。

hUSC 來源廣泛，獲取方便，具有較強的分化潛能。ZhANG 等［10］發現，hUSC 在連續培養后可保持正常的核型，具有表達尿路上皮細胞、平滑肌細胞、內皮細胞和間充質細胞標記物的細胞譜系的能力。

1.2 hUSC 的提取及培養 hUSC 來源于新鮮尿液，REN 等［11］研究結果發現，75% 的新鮮 hUSC 可以安全地在尿液中保存24 h，并且這些細胞依然具備平滑肌細胞以及尿路上皮細胞的分化能力。USC的培養基體系較為復雜，包括DMEM 高糖培養基、KFSM及因子、F12、胎牛血清、牛垂體提取物、表皮生長因子、胰島素、腺嘌呤、谷氨酸、轉鐵蛋白、地塞米松、雙抗等，培養基的成本較其他細胞略高。hUSC提取主要采用離心貼壁法，離心力為常溫下400～500 g、5～10 min［10，12-13］，但在后期細胞擴增和活性上無明顯區別。觀察到貼壁的 hUSC 的時間為 2～7 d［14-15］。原代細胞一般10～15 d融合率可達80%～90%，2～3 d可實現傳代。

1.3 hUSC 的優勢 多項研究表明，hUSC 呈曲線生長，可分為潛伏期、對數期和平臺期3 個時期［13］。KANG 等［16］對同一供體提取的 hUSC 和脂肪來源干細胞（ADSC）對比發現，hUSC 比 ADSC 的細胞增殖效率更高。P2～P7代USC 端粒酶長度隨著傳代不發生明顯變化，而BMSC 隨細胞傳代端粒酶長度逐漸縮短。以上結果說明，hUSC具備更長的端粒酶長度以及更高的端粒酶活性。

韓國的 KANG 等［16］提取 hUSC 及 ADSC，同代細胞相較，hUSC 具有較高的細胞增殖率、更強的集落形成能力、較強的干細胞標記表達陽性率及更高的抑制免疫細胞激活效率；在染色體穩定性分析中，兩種細胞在所有傳代中均表現出正常的核型；多系誘導發現，hUSC 表現出較高的成肌、成神經和成內皮細胞分化率，但成脂、成骨及成軟骨的分化率更低。

在一定條件下，分別用hUSC 和BMSC 同尿路上皮細胞培養，60%～70%的hUSC 可以表達尿路上皮特異性蛋白與基因，遠高于BMSC 誘導分化效率；另外hUSC 誘導分化的尿路上皮細胞，可以表達相關的基因蛋白ZO-1、E-鈣黏蛋白和扣帶蛋白，同時具備與膀胱組織細胞相似的屏障功能。

2 hUSC在軟骨和骨組織工程中的應用

2.1 hUSC在軟骨組織工程中的應用 多項研究發現，hUSC在體外誘導成軟骨培養，28 d后可表達成軟骨的相關基因及蛋白［17-18］。PEI等［19］報道，BMSC經過多次傳代后其軟骨分化能力會下降，hUSC分泌的細胞外基質可以改善并增強BMSC 的軟骨分化能力。王遠政等［20］研究也表明，hUSC能成功誘導成軟骨。

CHEN［21］在體外做 hUSC 成軟骨誘導后發現，hUSC可分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，兩者皆為軟骨表達的相關蛋白。該研究還將hUSC 與可注射透明質酸（HA）結合，并將hUSC-HA、HA 和單純hUSC 注射到兔膝關節、修復股骨髁軟骨缺損。12 周后發現，hUSC-HA具有更強的軟骨修復能力。

目前關于hUSC 修復軟骨的報道仍然較少，需進一步研究更加有效的誘導方法，爭取早日將其應用于臨床。

2.2 hUSC在骨組織工程中的應用 骨缺損是修復的難題，廣大學者也在組織工程三要素中極力探索，種子細胞是其重要環節。目前用于臨床的干細胞如BMSC、軟骨細胞等的獲取都要產生創傷，且具有潛在的并發癥。hUSC 為無創獲取的干細胞，來源廣泛，可作為骨組織工程的潛在細胞。

體外研究表明，hUSC通過誘導發現有成骨細胞表達。骨形態發生蛋白（BMP）轉染hUSC 可提高其成骨能力［18］。GUAN 等［22］發現，經 BMP-2 轉染的hUSC 高表達Runt 相關蛋白-2 和骨鈣素，而且較其他組有更多的新骨形成。XING 等［23］使用表面礦化的雙相磷酸鈣陶瓷（BCP）負載hUSC 修復新西蘭兔的臨界骨缺損，結果表明表面礦化BCP 在不影響hUSC 增殖的情況下，可促進hUSC 的成骨蛋白和基因表達，10 周后，負載hUSC 的表面礦化BCP 組的新骨形成量最高。

有研究將hUSC 接種在β 磷酸三鈣三維支架上（β-TCP），結果表明hUSC 在支架內成骨分化［24］。將細胞支架復合物植入修復大鼠6 mm的股骨缺損中，結果表明，支架復合hUSC 組內可見大量新骨形成，較單純β-TCP支架組及空白組其成骨力能更強。該團隊又用硅酸鹽、聚乳酸生物陶瓷復合支架（PLGA／CS）復合hUSC，并將細胞支架復合物植入裸鼠皮下，結果顯示硅酸鹽離子明顯增強了細胞的增殖、堿性磷酸酶活性、鈣沉積和某些成骨基因及蛋白的表達，組織學分析表明，PLGA/CS 復合支架能顯著促進 hUSC 在體內的成骨分化［25］。QIN 等［26］發現，4 μg/mL 的銀納米粒子（AgNP）可促進hUSC 誘導肌動蛋白聚合，增加細胞骨架張力，激活ras 同源家族成員A，因此適當濃度AgNP 可以促進hUSC 的成骨分化。該研究認為hUSC 可以作為骨組織工程種子細胞，銀離子可作為一種組織工程支架。可見，hUSC 具備與支架材料黏附、爬行及增長的能力，可作為骨軟骨組織工程的種子細胞。

綜上所述，hUSC 具有上皮干細胞的特性，在誘導成肌肉、成上皮、成神經的能力方面較其他的干細胞更強，但在誘導成骨、成脂和成軟骨能力方面，還需要進一步探索。