慢性乙型病毒性肝炎中醫證候蛋白質組學研究進展＊

鄧曉靖，雷亞云，曹貴霞，馮培民，2＊＊

(1.成都中醫藥大學臨床醫學院 成都 610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院 成都 610075)

慢性乙型病毒性肝炎，又稱慢性乙型肝炎(CHB，以下簡稱“慢乙肝”)，是因感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)而導致的肝臟慢性疾病，是一種嚴重影響人類健康的傳染性常見病。據世界衛生組織(WHO)統計全世界有超過2.57億人被感染，每年因HBV感染造成的死亡超過88.7萬人，大約40%的肝癌病例由慢乙肝發展而來，其死亡率在癌癥中居第2位[1]。盡管我國乙肝疫苗在預防乙肝中取得了不錯的成績，但2014年WHO發布的白皮書中提到在中國一般人群中乙肝病毒表面抗原流行率約為5.49%，仍有超過7400萬例HBV攜帶者[2]。目前核苷(酸)類似物和干擾素是抗病毒治療中的有效方案，但仍不能徹底治愈乙肝、不能徹底消除炎癥、不能逆轉所有肝硬化、不能完全阻斷肝臟癌變進程[3]。中醫藥治療慢乙肝在臨床中有豐富的病例報道，并有諸多成功案例，但由于醫學指征、癥候的不同，也存在較大的辨證差異，療效不確定等不足。

蛋白質組學(proteomics)是研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規律的科學。蛋白質組是指一種基因組所表達的全部蛋白質。蛋白質組的研究為眾多疾病機理的闡釋提供理論依據，并且亦為疾病的治療提供了可量化可衡量指標，是人類認識生命活動規律的重要手段。由于在疾病的不同階段，不同分型的蛋白質表達情況不盡相同，因此可以說蛋白質組是一個在空間和時間上不斷動態變化著的整體，這與中醫學“整體觀念”的認識相契合[4]。通過比較正常個體與病理個體之間的蛋白質組差異，可以找到疾病發生、發展過程中的特異性蛋白質分子，這為疾病的早期診斷提供了有效的分子標志，亦可成為新藥設計的分子靶點，因此近年來，在人類疾病發病機制、治療和藥物篩選研究中蛋白質組學被廣泛運用，并取得了大量有意義的結果[5-7]。

有研究表明，中醫“證”的本質是基因型及其表達，疾病的癥狀體征變化是基因及其在mRNA、蛋白質水平差異的外在表現[8]。慢乙肝中醫證候蛋白質組學是研究慢乙肝不同證型間差異蛋白質的有效方法，找到不同證型所對應的病理狀態下人體血清蛋白質組，組建不同證型蛋白質組學信息庫，從整體層面尋找慢乙肝的證侯分子標簽，是病證結合的中西醫結合現代化研究的新模式[9]，也是中醫學走“精準”技術層面的升級，應用蛋白質組學能夠全面系統地分析慢乙肝不同證型相關蛋白譜的特征及其差異，有助于進一步提高中醫證候診斷的客觀性，揭示中醫證候本質，為臨床應用提供重要的技術指導。本文將對慢乙肝中醫證型的蛋白組學研究現狀進行綜述，介紹目前蛋白質組學在中醫證候研究中的主要技術手段和研究方法，并對不同證型的慢乙肝蛋白組學研究現狀進行歸納總結，以期為當前慢乙肝中醫證候客觀化研究提供一定的理論和實驗依據。

1 蛋白質組學研究技術

蛋白質組學從本質上講是在細胞水平上對蛋白質進行大規模的平行分離和分析，因此其處理的數據是海量的，這就要求所采用的技術具有高通量、快速、準確、高效等特性，可以說蛋白質組學研究能否成功，在較大程度上取決于所采用的技術手段和研究方法水平的高低。近年來，物理和化學領域的技術進步為蛋白質組學的發展提供了強有力的手段，當前蛋白質組學的發展所采用的主要研究技術包括：

1.1 雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳是根據蛋白質的生理化學特性(等電點和分子量)進行蛋白質分離的一種方法，是蛋白質組學中最有用的復雜生物混合物蛋白質分離方法之一。首先，它根據蛋白質等電點的不同實現第一維等電聚焦分離，然后，在第二維中使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術根據分子量的不同將變性的蛋白質進行分離，從而在二維平面上將復雜蛋白混合物中的各個蛋白質片段分開。分離后的蛋白質可用于蛋白質轉錄及轉錄后修飾、蛋白質組的比較和蛋白質間的相互作用、致病機制及耐藥機制的研究等諸多方面，因此雙向凝膠電泳技術對蛋白質組學的研究具有十分重要的意義。目前所發展的雙向電泳技術具有對蛋白質檢驗比較靈敏、高分辨率的完整分離蛋白質等特點[10]，但同時也存在著對低豐度蛋白不敏感、極端相對分子質量蛋白漏檢、樣品處理復雜以及難以自動化等缺點[11]。

1.2 生物質譜技術

生物質譜技術是一種儀器分析技術，廣泛應用于生物和臨床樣品的分析，其基本原理是復雜混合物樣品在線分離后經離子化送入質譜儀，并被裂解為不同質量的碎片，通過辨別其質荷比(m/z)來確定樣品組分的分子量，從而推斷出蛋白質的組成。其目前已經發展成為蛋白質組學研究的重要工具，用于了解蛋白質組的結構和行為[12]。常用的質譜主要包括兩種：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧質譜(ESI-MS)。而生物質譜一般與液相色譜聯合使用(LC-MS)。

基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALDITOF-MS)的基本原理是將分析物分散在基質分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，激光能量被基質分子吸收，樣品解吸附，基質與樣品之間發生電荷轉移從而使樣品分子電離，離子化后的樣品在質譜飛行管中飛行從而被測定分子量。MALDI-TOF-MS一般用于小肽和多肽質量指紋圖譜的分析，是目前蛋白質組學檢測中最為常用的一種鑒定方法[13]，該技術具有檢測操作程序簡單、靈敏度較高、分析時間較短、短時間內可達到高通量、且分析時產生的電荷準分子離子抗干擾能力較強等特點[14]。此外，基于質譜的分子組織學新興技術基質輔助激光解吸電離質譜成像(MALDIMSI)的發展使可視化蛋白質組成為可能[15]。

電噴霧質譜(ESI-MS)是利用高壓電場將質譜進樣端毛細管柱流出液荷電，在氮氣氣流的作用下，液滴溶劑蒸發，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產生的庫侖力與液滴表面張力達到雷利極限，液滴爆裂為眾多荷電的子液滴，子液滴不斷重復這一過程，從而使最終的液滴呈非常細小的噴霧狀，此時液滴表面的電場非常強大，使分析物離子化并以荷電離子的形式進入質量分析器。分析過程無需其它的基質輔助，可以檢測原子質量單位幾千道爾頓的小分子乃至上百萬道爾頓的大分子待測物，并且可以通過改變噴霧溶劑種類，顯著提高不同種類待測物的萃取效率和選擇性等，但是也存在分析時間較長等缺點[16]。

1.3 同位素相對標記與絕對定量(iTRAQ)技術

目前定量蛋白質組學的研究手段主要包括：細胞培養穩定同位素標記技術(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)、同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)、非標記定量蛋白組學技術(Label-free)等，其中iTRAQ技術在慢乙肝中醫證候研究方面使用最為廣泛。

iTRAQ技術是利用多種同位素試劑標記蛋白質N段或者蛋白質中賴氨酸側鏈基團，然后通過高精度質譜儀進行分析測定蛋白表達量的方法。它一次可同時分析4-8個蛋白樣本，通過蛋白質信息學手段分析獲得差異蛋白的表達和定量。基于質譜分析的iTRAQ技術為蛋白質組學研究提供了樣本來源廣、高通量、高敏感性、高特異性、高重復性、操作相對簡單的方法，是當今定量蛋白質組學研究的重要高通量篩選技術之一[17]。但也存在一些明顯的缺點，如在樣品前期處理階段，樣品酶解程度對結果的測定有非常大的影響，甚至會出現樣品處理不當，結果偏差令人無法接受等問題；此外對于蛋白質的定量，iTRAQ主要依靠在二級質譜中離子峰面積比值計算，對其篩選差異蛋白也會產生一定影響。

1.4 蛋白質芯片及細胞因子抗體芯片技術

蛋白質芯片是一種檢測蛋白質存在和變化的高效技術，它為蛋白質組學的研究提供了新的有力工具。其工作原理是：酶、抗原、抗體、細胞因子等探針蛋白分子與經化學處理的固體載體結合所得到的基質，處理血清、血漿等樣品時，存在于這些樣品中的某些蛋白就會與探針分子產生特異性結合，從而被探針分子捕獲，經過洗滌、純化后的結合蛋白可以采用質譜檢測技術進行確認，這為研究疾病發展過程中蛋白質譜的變化規律提供了有力的技術支持。目前已有關于IMAC3、WCX2芯片和SELDI-TOF-MS技術檢測分析和交叉驗證慢性肝病患者的血清中特異蛋白，并根據蛋白的分子量和組織來源在蛋白數據庫中檢索、確定目標蛋白成為分子標志物的報道[18]。

細胞因子抗體芯片是近年來發展起來的一種高通量免疫檢測分析方法，可以應用于同時檢測微量樣品中大量細胞因子表達水平的快速定性分析，可實現對相關細胞因子表達水平進行高通量、高特異性和系統重現性的檢測，對不同樣品之間細胞因子的相對表達豐度具有突出的表現[19]。細胞因子抗體芯片目前已經廣泛應用于多種疾病生物標志物的篩選和鑒定[20-22]，在慢乙肝中醫證候客觀化研究方面已有報道[23]。

2 蛋白質組學研究與慢乙肝中醫證候客觀化

中醫學認為慢乙肝是由濕熱疫毒之邪內侵機體，正氣不足無力抗邪時而發病，多因外感、情志、飲食、勞倦而誘發。2018年中華中醫藥學會肝膽病專業委員會制定了《慢性乙型肝炎中醫診療指南》[24]，提出慢乙肝常見的中醫證型分5種，分別為：肝膽濕熱證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、瘀血阻絡證、脾腎陽虛證，其中，又以肝膽濕熱證和肝郁脾虛證最為常見。近年來的研究表明：通過對慢乙肝不同證型進行蛋白組學分析，發現不同證型與正常組、證型與證型間都存在著不同的差異蛋白質，而這些蛋白質的表達在一定程度上也影響了不同慢乙肝患者的癥狀、體征等外在表現，充分證明了不同中醫證候具有不同的客觀化指標。

2.1 肝膽濕熱證

戴幸平等[25]用MALDI-TOF-MS生物質譜技術對慢乙肝中醫辨證為肝膽濕熱證的患者和正常人進行了差異蛋白質鑒定分析，找到了46個差異蛋白質點，并初步鑒定了一些慢乙肝肝膽濕熱證型差異表達的蛋白質。發現慢乙肝肝膽濕熱證的病理過程中有可能發生單個核細胞的激活、細胞運動減弱以及可能影響細胞免疫功能；也有一定概率存在肝細胞抗損傷能力降低。隨后對清肝利濕湯治療慢乙肝肝膽濕熱證外周血單個核細胞的蛋白質表達譜的差異進行了分析，結果發現細胞凋亡信號分子、凝血相關蛋白、細胞免疫及能量代謝相關酶可能是清熱利濕湯治療慢乙肝肝膽濕熱證的作用靶點[26]。最近，席婷[27]對慢乙肝肝膽濕熱型表達蛋白的研究中發現I-309(重組人趨化因子CCL1)、MCP-1(單核細胞趨化蛋白-1)、SDF-1(基質細胞衍生因子-1)、FAP(成纖維細胞激活蛋白)、M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子)、IGF-1(胰島素樣生長因子-1)、VCAM-1(血管細胞黏附分子-1)在慢乙肝肝膽濕熱證表達水平升高，而ApoM(載脂蛋白M)呈低表達，提示慢乙肝肝膽濕熱證中細胞免疫反應比較活躍且存在著炎癥損傷，這與筆者相關課題組的研究結果相契合。筆者[28]對慢乙肝肝膽濕熱證患者及健康對照組的血清采用蛋白質芯片技術、iTRAQ結合液相色譜和質譜串聯的蛋白質組學定量分析發現：肝膽濕熱證組與健康人組相比，IGF-1有顯著性差異，表明肝膽濕熱證組中細胞的增殖、分化和凋亡比較劇烈。

2.2 肝郁脾虛證

劉友平等[29]通過對比分析慢乙肝肝郁脾虛證及健康人的血漿蛋白質組表達譜，發現與正常對照相比較肝郁脾虛證存在8個明顯的差異表達蛋白點，但遺憾的是未能對差異表達蛋白質的結構和功能做進一步更加深入的研究。陳文莉等[30]對慢乙肝肝郁脾虛證、濕熱中阻證及健康男性的血清進行了差異蛋白質組學分析，經MALDI-TOF-MS分析鑒定出7個差異表達的蛋白質，在對這7個差異蛋白的生物學功能進行研究后，發現肝郁脾虛組中與肝功能、以及機體免疫水平相關的蛋白表達降低，且纖維化趨勢更明顯，同時檢測出CRP和SAMP顯著升高，從而表明肝郁脾虛患者存在明顯的乙肝炎癥活動。楊健坤等[31]應用iTRAQ技術對慢乙肝肝郁脾虛證、脾胃濕熱證的血清差異蛋白表達譜進行了廣泛篩查，在肝郁脾虛證組與正常對照組的比較中發現了30個差異表達蛋白，后續的差異蛋白生物學功能研究表明TU BAl A可能是慢乙肝肝郁脾虛證的潛在生物學標志物，可用于慢乙肝肝郁脾虛證分組；此外，還發現LGALS3BP(可溶性半乳糖凝集素3結合蛋白)在慢乙肝患者中存在差異表達，亦有可能成為肝郁脾虛證的良好標志物；而在肝郁脾虛證中上調的PON3(血清對氧磷酶3)可能對肝組織改變和導致肝病的肝細胞凋亡起保護作用[32]。

2.3 虛證(肝腎陰虛證、脾腎陽虛證)

王磊瓊等[33]對中醫虛證(肝腎陰虛證、脾腎陽虛證)慢乙肝患者和健康正常人血漿進行了差異蛋白質的分析鑒定，發現慢乙肝中醫虛證中APO-A2、HP表達均明顯下降，從而推測肝細胞的損害、脂代謝紊亂、肝細胞合成HP的能力下降、分解增加、機體的非特異性免疫力下降均與慢乙肝中醫虛型證型的形成機制有關，進而認為慢乙肝中醫二虛證(肝腎陰虛證、脾腎陽虛證)具有相同的蛋白質變化規律。劉友平等[34]采用雙向電泳技術結合質譜分析對慢乙肝脾腎陽虛證患者及健康對照者的血漿蛋白質表達譜進行研究，共鑒定出7個差異蛋白，其中VN、載脂蛋白等反映肝臟分泌功能的蛋白質在脾腎陽虛證中呈較低水平，脾腎陽虛證組中急性時相蛋白SAMP較對照組下調，這充分說明慢乙肝脾腎陽虛證中肝臟組織不存在明顯的炎癥反應，而表現為明顯的蛋白合成功能障礙。

2.4 脾胃濕熱(濕熱中阻證)

魏嵋等[35]對慢乙肝濕熱中阻證患者及健康對照的血漿蛋白質，通過質譜分析鑒定獲得7個蛋白點，認為慢乙肝濕熱中阻證患者肝臟損害較輕微，亦無明顯的炎癥反應，以及差異表達蛋白Apo AⅠ、Apo AⅣ對慢性乙肝濕熱中阻證的診斷、藥物治療及臨床預后具有重要價值；然而陳文莉等[30]的研究則認為在濕熱中阻證中急性時相蛋白以及和脂類代謝有關的蛋白質表達較高，臨床表現出的濕熱證候相關癥狀越明顯，肝功能損害越重，所以對比正常組反應急性時相蛋白質如CRP(C反應蛋白)、SAMP(血清淀粉蛋白P)在濕熱中阻組中表達升高較突出。楊健坤等[31]在脾胃濕熱組篩選出24個差異表達蛋白，其中AcTA2、AcTG 2、zN F628、DEFAl、D EFA3、caM可能是慢乙肝脾胃濕熱證的潛在生物學標志物；同時作者還發現了慢乙肝脾胃濕熱證特異性差異表達的蛋白，如ITIH1(α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H1)，THBS1(血小板反應蛋白-1)，C5(補體C5)和ALB(白蛋白)，其中ITIH1的低表達表明可用于區別慢乙肝脾胃濕熱證和肝郁脾虛證。

慢乙肝是一種傳染性疾病，中醫學認為其是由于外來邪氣入侵，正氣不能鼓邪外出，正邪交爭于內而發病，其病因應歸于“疫毒、雜氣”。一般而言，濕熱證患者感邪較重，正氣亦不虧，濕熱毒邪內蘊肝膽、中焦，正邪抗爭劇烈，屬“實證”，上述蛋白質組學研究亦提示肝膽濕熱證組機體內有較重的炎癥反應以及較強的細胞免疫，脾胃濕熱證組結果同肝膽濕熱證相類似，表現為肝細胞損害較重，同時細胞修復及能量代謝調節活躍；肝郁脾虛證患者感邪后肝氣失于疏泄，郁結而橫逆犯脾，致脾氣虧虛，正氣不足，正邪交爭不如濕熱證，蛋白質組學結果則表明其炎癥表現較輕，而肝纖維化趨勢明顯；虛證患者由于原本素體正氣虧虛或久病正氣消耗，其正氣無力與邪氣抗爭，相關蛋白質組學研究顯示肝細胞損害較輕，但細胞的正常合成功能受到了影響；綜上所述，慢乙肝中醫證候的蛋白質組學研究結果與中醫理論在一定程度上相契合，這對闡述慢乙肝中醫證候的客觀化具有一定的指導性意義。

3 蛋白質組學研究揭示慢乙肝中醫證候間差異的生物學基礎

慢乙肝中醫證候的準確判斷是中醫藥對癥治療的關鍵和基礎。慢乙肝的發生、發展是多環節、多因素參與的復雜過程，在分子水平上講，不同的證侯是不同功能的蛋白質參與其中的結果。在研究慢乙肝不同中醫證候差異性蛋白質的基礎上發掘出辨證的標志性蛋白質，并通過對慢乙肝患者血清蛋白質進行鑒定、評估，可以在一定程度上提高中醫辨證的準確度，實現辯證的“可量化”“精準化”，更易于使中醫為現代醫學所理解和接受。

周威龍等[36]篩選了慢乙肝脾胃濕熱證、肝郁脾虛證、健康者的證候間差異蛋白，并對其進行了生物學功能研究，結果顯示肝郁脾虛組和脾胃濕熱組存在61個差異表達蛋白，其中16個表達上調，45個表達下調，兩證型之間差異蛋白主要包含了脂肪酸代謝、視黃醇代謝、精脯氨酸代謝、丙-谷-天冬氨酸代謝、氧化磷酸化代謝以及與肝酶P-450相關的毒物和共棲代謝通路，它們和處于差異蛋白功能網圖中交點位置的YWHAH、RhoA、RhoC、ATP5A1、ATP5B、CDH1蛋白都有可能是證候間差異的生物學基礎。最近，筆者課題組[37]采用iTRAQ聯合LC-MS/MS技術對慢乙肝肝郁脾虛、肝膽濕熱、脾胃濕熱證型進行研究，發現各證型之間存在差異蛋白表達，以及具有顯著統計學差異的蛋白通路，并且差異蛋白功能表達也具有顯著差異，這充分說明不同證型蛋白質功能發揮作用時的途徑亦有不同，各證型均有不同的病理和轉歸過程，從而有效證明慢乙肝的傳統中醫辨證不是仁者見仁智者見智的憑空想象，而是有著深刻的微觀生物學基礎，這與現代西醫的“物質可量化”觀點之間不謀而合，充分佐證了中醫的科學性和科學內涵。

4 問題與展望

蛋白質組學作為研究慢乙肝中醫證候差異，提高辨證準確度和評估預后的重要手段已被中醫界所廣泛接受，并取得了豐富的成果，為慢乙肝辯證分型提供了可參考、可量化的指標，促進了中醫辯證技術的客觀化，為慢乙肝的辯證分型和辯證施藥提供了重要參考和技術手段，但也應該看到目前仍存在許多不足之處，如：①當前大多數蛋白質組學研究納入的病例數偏少，且揭示的結果難以得出統一的結論，還需要進一步擴大樣本量進行更大范圍的驗證；②由于目前研究中發現的慢乙肝中醫證候差異蛋白數量較多，暫時不能完全進行差異表達蛋白質結構和功能的鑒定，需進一步分析差異表達的蛋白質在慢乙肝發生和發展過程中的生物學意義，并發掘出辨證的標志性蛋白質；③慢乙肝中醫證候蛋白質組學研究中發現的生物標志物尚依賴于進一步臨床研究的證實，多種差異蛋白的作用機制尚不明晰，其在臨床診斷、評估中的應用仍有待深入研究。不過，相信隨著蛋白質組研究手段的不斷進步和高通量篩選技術的發展，快速、低成本鑒定差異蛋白，實現蛋白與功能的一一對應將成為可能，這必將從根本上揭示慢乙肝證候的生物學基礎，闡釋慢乙肝中醫證候的本質。

傳統中醫學的發展一直與臨床實踐聯系密切，形成了“方證對應”的基本診療模式，客觀上強調方劑與證候之間的一一對應關系，強調“辨證施藥”，而蛋白質組學恰好從微觀物質基礎角度提供了中醫證候的客觀解釋，使得辯證施藥有了物質作用基礎，這為中醫理論的現代發展提供了有力支撐，因此，可以說蛋白質組學是唯物論在中醫學中的體現和再實踐。以蛋白質組學作為微觀物質基礎，“中醫證候”與“方劑”形成了巧妙的對應關聯，“蛋白質組學”“中醫證候”和“方劑”三者之間形成了互為支撐的客觀事實，其中“蛋白質組學”和“中醫證候”之間的關系是：“蛋白質組學”揭示了“中醫證候”的物質基礎，“中醫證候”為蛋白質組差異的外在體現；而“蛋白質組學”和“方劑”之間的關系是：蛋白質組是中藥方劑中有效成分的作用靶點，中藥多組分、多功能、多通路協同作用與蛋白質組中呈現的多作用靶點相對應和鍥合；同時，“方劑”和“中醫證候”之間的關系則是：“證候”是“方劑”的施藥基礎，而“方劑”則是“證候”的客觀量化和解決對策；因此，在慢乙肝中醫證候與蛋白質相關關系的基礎上，我們應該重視和加入“方劑”的研究，這不僅有助于進一步認識慢乙肝中醫證候與蛋白質組之間的關聯性，并且方劑與蛋白質的作用及其在證候上的反映，更有助于理解蛋白質的作用靶點及作用機制，這可為創新藥物的開發和慢乙肝病理機制的闡釋提供更加豐富的數據和事實支撐。

此外，蛋白質組學與慢乙肝中醫證候的關系研究，不應該被割裂和孤立，而應該在更大的視角下進行觀察和深入思考，特別是近年來隨著基因組學、代謝組學的發展，將蛋白質組學與之相關聯，將有助于更全面、更寬闊的視角下理解研究慢乙肝中醫證候與蛋白質組學的關聯性，更加深刻的揭示慢乙肝中醫證候的科學本質，從而真正實現中醫理論的現代化，使得中醫藥發展邁向精準時代。