新型陽離子核酸載體的細胞轉染效率研究

周思汝

摘要：目的：研究新型陽離子核酸載體的細胞轉染效率。方法：運用MTT比色法對DNA和LW13-2不同比例下的細胞毒性進行分析;在熒光顯微鏡下對轉染效率進行計算。結果：LW13-2細胞存活率會伴隨著DNA比例的增加而降低。DNA在轉染復合物中的含量較少，DNA和LW13-2質量比為1：1、2：1、3：1，細胞存活率均在90%以上;當DNA：LW13-2為1：3時，轉染率最高能夠達到88.6%。轉染率下降，DNA：LW13-2為1：5～6，促使大量細胞破碎和死亡。結論：將新型的陽離子脂質體核酸載體LW13-2應用到體外核酸轉染中，展現出了較強的優勢，為后續的基因治療研究工作提供了載體系統。

關鍵詞：細胞轉染;陽離子;核酸載體

【中圖分類號】 R254? ? 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）17--01

陽離子核酸載體作為基因治療中一項新型的治療技術，通過將適宜的載體導入到靶細胞中，有助于確?；虻某掷m性和穩定性。核酸傳遞載體自身具有較強的應用價值，其在實際的使用過程中，展現出了較強的治療效果及治療質量，是一種關鍵性的治療因素，通過與各種材料及基團有機的組合在一起，形成一種新型的核酸載體，被廣泛應用于醫學領域中，成為醫學行業的熱點研究問題。

1資料及方法

1.1一般材料

1.1.1實驗材料

新型核酸載體材料LW13-2作為本次實驗的主體材料，該材料在實驗中保存，在大腸桿菌DH5中擴增，QIAgene質粒主要是從試劑盒中提取出來，在0.22μm微孔來完成除菌，放在-20℃下進行保存。所有的細胞均使用10%胎牛血清的DMEM進行培養。

1.1.2實驗儀器

CO2培養箱、酶標儀、倒置熒光顯微鏡、超凈工作臺。

1.2方法

1.2.1LW13-2細胞毒性測定

運用LW13-2對細胞的毒性進行測定，運用MTT比色法來進行測定，將HEK293細胞種入到96孔的細胞培養板中，其中含有100μL10%的FBSDMEM，5%的CO2，培養的時間控制在24h，在37℃下進行培養。LW13-2和Li-po2000各100μL，將以上兩種物質溶解在PBS中，并將配成不同比例的轉染試劑加入到各細胞孔中，取4個復孔的平均值。在對照孔中培育PBS溶液，培養的時間控制在24h。將5mg/mL的MTT溶液50μL加入到孔中，在37℃下培養4h，確保MTT能夠還原為甲瓉，將培養板中的所有液體輕輕棄去，可見在細胞內形成甲瓉結晶。為了使甲瓉結晶能夠快速溶解，需要將150μL二甲基亞砜DMSO加入進去，振蕩10min。使用酶標儀來測定波長吸光值，對細胞的存活率進行計算，計算方法為：細胞存活率=（試驗組吸光度/對照組吸光度）100%。對計算結果進行分析可知，細胞存活率與細胞的毒性呈正相關關系，當細胞的存活率≥90%時，則可判定為低細胞毒性[1]。

1.2.2細胞轉染操作及轉染效率測定

取6只EP管，分別加入到EGFP質粒DNA5μ中，按照陽離子轉染試劑方法加入，依次加入LW13-2和轉染復合物懸液，將液體放置在溫室中5min，之后將事先準備好的96孔細胞加入到細胞培養皿中，完成轉染實驗，之后對5%CO2放置在37℃條件下繼續培養，對轉染效率進行計算。

1.2.3血清對基因轉染效率的影響

細胞準備工作如前，按照3：1的質量比來準備轉染復合物，分別加入5%、10%的復合物溶液及無血清DMEM，對液體進行輕輕混勻，將其放置在溫室內，時間到達5min后，再將其加至到細胞上。

1.2.4培養時間對基因轉染效率的影響

轉染復合物的質量比控制在3：1，細胞準備工作如前所示，待作用4h后，棄轉染液，將含有10%的FBS加入到DMEM中，繼續進行培養，培養時間為8、12、24和48h時，對細胞的生長情況進行觀察，并計算出與GFP熒光細胞的比例。

2結果

2.1細胞毒性測定

在細胞液中加入不同濃度的轉染試劑，細胞培養的時間控制在24h。測定結果顯示，LW13-2細胞存活率會伴隨著DNA比例的增加而降低。DNA在轉染復合物中的含量較少，DNA和LW13-2質量比為1：1、2：1、3：1，細胞存活率均在90%以上。將0.8μgDNA和2μLLipo2000，形成轉染復合物，作用的時間控制在24h后，可知細胞的存活率在96.3%以上，與LW13-2的轉染復合物質量相比，兩者之間的細胞毒性水平較為接近，不會對細胞活力造成較大的影響。

2.2不同因素對LW13-2基因轉染效率的影響

通過顯微鏡進行觀察，對不同比例的質粒及新型核酸載體混合物進行細胞轉染，在48h后進行觀察，發現細胞體內出現了明顯的綠色熒光，說明這一新型的核酸載體自身具有良好的轉染活性。并且熒光的強度也會隨著LW13-2含量的增加而增強。轉染率最高能夠達到88.6%，當DNA：LW13-2為1：3時所表現出來的。轉染率下降，DNA：LW13-2為1：5～6，導致轉染率急劇下降，促使大量細胞破碎和死亡。

3討論

在本次實驗中，通過對新型的陽離子脂質體核酸載體LW13-2進行合成，完成了對陽離子的改造和選擇，增加了核酸載體細胞的靶向性，確保了基因治療工作的發展。對轉染效果的影響因素進行分析，可知質粒DNA和陽離子脂質體時重要因素，通過將兩者混合，促進了脂質體的形成，核酸物質形成于囊泡結構中，避免核酸酶發生降解。在不含血清的情況下，轉染效果最好，說明LW13-2在基因轉染實驗中取得了較好的轉染效率。轉染試劑Lipo2000作為一種陽離子脂質體，被廣泛應用于體外基因轉染中，在本次實驗中，主要采用對比試劑研究的方式，對新型的陽離子脂質體核酸載體轉染效率進行計算。實驗結果表明LW13-2與Lipo2000具有相同的細胞毒性，細胞的整體存活率均在90%以上，DNA的轉染率高于Lipo2000，兩者之間差異性顯著。將新型的陽離子脂質體核酸載體LW13-2應用到體外核酸轉染中，展現出了較強的優勢，為后續的基因治療研究工作提供了載體系統[2]。

參考文獻：

[1]尹亞軍，李蕊清，劉歡，田蕾銘，張力瑞，張輝，路宏朝，張濤.高分子聚合物對兩種細胞轉染效率的研究[J].陜西理工學院學報（自然科學版），2016，32（01）：64-69.

[2]王偲穎，林靖，韓媛媛，張華，黃盛文.陽離子脂質體介導肽核酸轉染K562細胞的研究[J].貴州醫藥，2016，40（04）：341-343.