圍墾對崇明東灘濕地全程氨氧化微生物的影響①

宋怡軒，金 銳，張鑫磊，張 潔，賈仲君，張耀鴻*

圍墾對崇明東灘濕地全程氨氧化微生物的影響①

宋怡軒1,2，金 銳1，張鑫磊1，張 潔1，賈仲君2，張耀鴻1*

(1南京信息工程大學氣象災害預報預警與評估協同創新中心/江蘇省農業氣象重點實驗室，南京 210044；2土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008)

全程氨氧化細菌(complete ammonia oxidizers，Comammox)的發現根本改變了學術界對硝化過程的認識，但其地理分異規律及對氮轉化過程的貢獻仍不清楚。本研究選擇長江口崇明東灘不同圍墾年限(0、27、51、86 a)稻田表層耕作土壤，采用好氧培養試驗測定土壤硝化潛力；通過標靶功能基因實時熒光定量硝化微生物的數量變異特征，包括全程氨氧化細菌(Comammox)、氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)。結果表明，與圍墾0 a的自然灘涂濕地相比，圍墾27、51、86 a的水稻土凈硝化速率從N 2.24 mg/(kg·d)分別增加至N 19.3、11.6和11.4 mg/(kg·d)，增幅高達5.1 倍~ 8.7倍。AOA的豐度與圍墾年限顯著正相關。自然灘涂濕地中AOA和AOB的數量分別為0.34×107copies/g和1.14×107copies/g，圍墾86 a后增幅最高可達27.9倍。自然灘涂濕地中Comammox Clade A和Clade B的基因拷貝數高于圍墾稻田土壤，且Comammox Clade A隨著圍墾年限增加其豐度顯著增加。統計分析發現，AOB與土壤硝化速率顯著正相關，可能在圍墾水稻土氨氧化過程中發揮了重要作用；而Comammox Clade A和Clade B與土壤總有機碳(TOC)、銨含量(NH4+)呈顯著負相關關系，可能更適應于營養貧瘠的灘涂自然濕地土壤。

圍墾；全程氨氧化細菌；氨氧化

氨氧化作用作為土壤氮素轉化的關鍵過程之一, 是硝化過程的限速步驟。一直以來，人們普遍認為硝化作用由兩類不同的化能自養型細菌：氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)和亞硝酸鹽氧化細菌(nitrite-oxidizing bacteria, NOB)完成的兩步氮循環過程[1-2]。2004年，化能自養型氨氧化古菌(ammonia- oxidizing archaea, AOA)被發現，隨后的許多研究表明，這類微生物在土壤和水生系統的硝化過程中發揮著重要作用，豐富了驅動好氧氨氧化過程的微生物類型。從熱力學和動力學角度來看，相比于經典分步硝化，獨立完成氨氧化和亞硝酸鹽氧化的全程氨氧化過程產生的能量更多，在產率較高而生長速率較低的條件下具有更大優勢[3-4]。2015年，Daims等[3]和van Kessel等[5]發現了硝化螺菌屬(spp.)中有微生物能全程完成硝化作用，即一步將氨氮轉化為硝態氮，這類微生物統稱為全程氨氧化細菌(complete ammonia oxidizers, Comammox)。該細菌的發現使人們對氮循環過程有了一個全新的認識。通過分析宏基因組學數據發現Comammox細菌與硝化螺旋菌屬spp.中其他微生物生境相似，廣泛分布于土壤、淡水濕地、地熱溫泉、污水處理廠和飲用水處理系統中[3, 5-6]。然而，Comammox在濱海濕地生態系統中的分布特征和生態學重要性卻鮮有報道。

崇明東灘位于長江口崇明島的最東端，是長江口規模最大、發育最完善的河口型潮汐灘涂濕地。入海徑流攜帶的泥沙在河口附近沉積，塑造了廣闊的潮灘濕地。隨著經濟的發展，人類對土地的需求越來越迫切，灘涂圍墾改農田成為解決土地問題的有效途徑。一方面，圍墾區的土壤來自于灘涂淤積的泥沙，土壤發育時間相對較短，其土壤本底較為均一；另一方面，圍墾后的濕地不再受潮汐影響，與近海間的物質能量交換基本消失，特別是水稻種植、翻耕、施肥等農業管理措施，使圍墾區生境發生顯著變化，形成了獨特的濕地類型：圍墾區稻田濕地，特別是大量的農業活性氮進入稻田生態系統后，使其成為氮循環的熱區。因此，開展濱海河口濕地土壤氨氧化過程及其相關功能微生物的研究，有助于深入認識圍墾造田和農業氮輸入對氮關鍵轉化過程的作用機理，具有重要的理論意義與科學價值。

基于此，本文以典型濱海河口濕地——崇明東灘為研究區，采用空間代替時間的研究方法，研究圍墾造田條件下濱海濕地土壤的好氧氨氧化過程，探討其空間變異特征及主要影響因素；通過微生物分子生物學研究方法，分析濕地土壤中全程氨氧化微生物(Clade A 和 Clade B)和經典氨氧化微生物(AOA 和 AOB)的豐度變化，評估這些微生物功能基因的生態位分化及其對硝化作用的相對貢獻，以期為長江口濕地環境保護與生態治理提供重要的參考依據。

1 材料和方法

1.1 土壤樣品采集

采樣地點為上海市崇明島(121°09′ ~ 121°54′E，31°27′ ~ 31°51′N)，屬于典型的亞熱帶季風氣候，終年溫熱，降水充沛，年均溫15.3 ℃，年降水量1 003.7 mm[7]。本研究選取東灘濕地保護區灘涂土壤為圍墾 0 a土壤作為對照，其他3個水稻土的圍墾年限分別為27、51、86 a。圍墾植稻不同年限的實驗樣點根據Cui等[8]的參考文獻選取。為了使采樣點能更準確反映不同的土壤發育年限，更具代表性，在每個樣區內以S形設置6個采樣點，各采樣點間距約為10 ~ 15 m，用土鉆取表層0 ~ 20 cm鮮土，并將該6個采樣點的土壤均勻混合為1個混合樣本，于保溫箱加冰袋保存運回實驗室冷凍保存備用。

1.2 土壤理化性質測定

土壤理化性質的分析測定主要參考《土壤農業化學分析方法》[9]。土壤全氮含量采用半微量凱氏定量法測定。土壤總有機碳采用濃硫酸–重鉻酸鉀消煮，硫酸亞鐵滴定法測定。土壤NH4+-N和NO– 3-N用2 mol/L KCl溶液浸提后，采用AA3流動分析儀測定；亞硝態氮采用重氮反應–比色法測定。土壤pH采用水土比為2.5︰1提取水溶液后，用數字酸度計(PHSJ- 6L，上海儀電科學儀器股份有限公司)測定；土壤電導率用電導法測定，采用水土為5︰1提取水溶液后用電導率儀(DDSJ-319L，上海儀電科學儀器股份有限公司)測定。

硝化速率的測定采用好氣培養法[10]，取沉積物土樣10 g(干基)，加15 ml去離子水，將土樣分散均勻，形成懸濁液。稱取總重量并記錄。25 ℃避光預培養7 d以便激活土壤微生物。預培養結束后，將每個土樣分為兩組：第一組的3個錐形瓶，直接測定其中的NO– 3-N含量(0)。第二組的6個錐形瓶中，用移液槍加入(NH4)2SO4溶液使N最終濃度達到200 mg/L，再根據重量法補加去離子水，使之去離子水總量為20 ml。然后在恒溫培養箱中25 ℃避光培養7 d后，取出錐形瓶，測定其中的NO– 3-N 含量(= 7)。

硝化速率的計算公式為：

式中：為硝化速率(N, mg/(kg·d))；(NO– 3)和(NO– 3)0分別為7 d和0 d 時NO– 3-N含量。

1.3 土壤DNA提取

利用Fast DNA Spin kit for soil提取試劑盒 (MPBiomedicals, USA) 提取土壤樣品中的總DNA，取0.5 g土壤樣品，按試劑盒提供的試劑和步驟提取DNA，FastPrep?FP120 細胞破碎儀以速度 6 m/s，時間 40 s進行細胞破碎。取部分DNA提取液用分光光度計(NanoDrop -1000 UV-Vis)測定DNA濃度和純度( OD260 /OD280和OD260 /OD230)。土壤DNA保存于–80 ℃冰箱待用。

1.4 實時熒光定量PCR

在C1000TMReal-Time System擴增儀上進行實時熒光定量PCR擴增。測定氨氧化古菌(AOA)、氨氧化細菌(AOB)和全程氨氧化細菌(Comammox Clade A與總Comammox)的基因拷貝數。AOB、AOA、總Comammox和Comammox Clade A的基因定量 PCR 所用擴增引物和擴增條件見表1[6,11-14]。反應體系均為20 μl，包括DNA樣品1 μl、Taq DNA聚合酶10 μl、前后引物各0.5 μl、無菌水8 μl。

表 1 AOA, AOB, Comammox Clade A和總Comammox 的amoA基因引物序列及其擴增條件

提取AOA、AOB、Comammox Clade A和總Comammox的基因的重組質粒，并通過測序驗證，再用分光光度計( NanoDrop ND-1000 UV-Vis)測定質粒濃度，并用無菌水將質粒稀釋6 ~ 8個梯度，用于制作定量PCR的標準曲線，根據標準曲線計算出目的基因的拷貝數。Comammox Clade B基因的拷貝數為總Comammox 與Comammox Clade A的差值。

1.5 數據統計分析

用IBM Statistics SPSS 16.0軟件進行統計分析，通過單因素方差分析(one-way ANOVA)和Pearson分析土壤理化性質、氨氧化微生物豐度的差異性以及相關性檢驗，顯著性水平= 0.05。

2 結果與分析

2.1 不同圍墾年限濕地土壤的理化性質變化特征

崇明島濕地不同圍墾年限土壤理化性質如表2所示。長期植稻顯著提升了水稻土無機氮含量，降低了硫酸鹽含量。圍墾稻田土壤NO– 3含量為11.79 ~ 18.67 mg/kg，是未圍墾灘涂濕地土壤的1.8倍 ~ 2.9倍；圍墾稻田土壤NH4+含量為14.48 ~ 23.37 mg/kg，比未圍墾灘涂濕地土壤高出1.1倍 ~ 2.7倍；且圍墾51 a稻田土壤的NH4+和NO– 3含量均顯著高于其他3個采樣點。土壤NO– 2含量在不同采樣點之間沒有顯著差異。土壤SO2– 4 濃度與EC值的變化趨勢一致，也隨著圍墾年限增加而明顯減小，且未圍墾灘涂濕地土壤顯著高于圍墾稻田。圍墾稻田的土壤總有機碳(TOC)介于15.29 ~ 18.34 g/kg，顯著高于未圍墾的自然灘涂濕地，且隨圍墾年限增加有顯著增加的趨勢。土壤全氮(TN)含量介于0.84 ~ 1.12 g/kg，4個采樣點之間沒有顯著差異。未圍墾灘涂濕地土壤的pH為7.86，顯著高于圍墾稻田。土壤電導率隨著圍墾年限的增加顯著減小，且未圍墾灘涂濕地土壤的EC值是圍墾稻田的3.2倍 ~ 6.9倍。

表2 不同圍墾年限土壤的理化性質

注：同一列數據小寫字母不同表示不同圍墾年限處理間差異達<0.05顯著水平，下表同。

2.2 不同圍墾年限濕地土壤的硝化速率

如圖1所示，圍墾0 a的自然灘涂濕地硝化速率最低，僅為N 2.22 mg/(kg·d)，圍墾27、51、86 a后水稻土硝化速率分別為N 19.3、11.6和11.4 mg/(kg·d)，增幅高達8.7倍、5.2倍和5.1倍。其中，圍墾27 a稻田土壤的硝化速率顯著高于圍墾51 a和86 a土壤，分別高出66% 和67%。

圖1 不同圍墾年限土壤的硝化速率

2.3 氨氧化細菌和古菌的豐度特征

由圖2可知，圍墾0、27、51、86 a的土壤AOA的基因拷貝數(以每克干土計)分別為0.34×107、1.10×107、4.07×107、9.95×107copies/g，隨著圍墾年限增加而顯著增大(< 0.05)。圍墾27、51、86 a的稻田土壤AOB的基因拷貝數(以每克干土計)為8.43×107、6.96×107、6.69×107copies/g，分別是圍墾0 a灘涂濕地土壤的7.4倍、6.1倍和5.9倍。相關性分析發現，4個采樣點的AOB基因拷貝數與土壤硝化速率呈顯著正相關(= 0.96*)。

2.4 全程氨氧化細菌的豐度特征

近年來國外研究者發現了具備單獨將NH4+氧化為NO– 3的可純培養細菌，均屬于亞硝酸鹽氧化細菌中的硝化螺菌屬，被稱為全程氨氧化細菌。由圖3可知，圍墾0、27、51、86 a土壤的Comammox Clade A 拷貝數分別為1.04×107、0.14×107、0.64×107、1.00×107copies/g。其中，圍墾稻田土壤的Clade A 拷貝數隨著圍墾年限增加而顯著增大，但均低于圍墾0 a的灘涂濕地土壤。Comammox Clade B在4個采樣點中的豐度特征與Clade A變化特征有所不同，其拷貝數分別為5.73×106、1.78×106、0.48× 106、2.04×106copies/g；其中，圍墾稻田土壤的Clade B 拷貝數均顯著低于圍墾0 a的灘涂濕地土壤。

圖2 不同圍墾年限濕地土壤AOA和AOB amoA功能基因拷貝數

2.5 不同氨氧化微生物之間的豐度比值

由表3可見，崇明島圍墾年限0、27、51、86 a的土壤中，不同氨氧化微生物之間的豐度比值AOA/AOB介于0.13 ~ 1.49，表明這兩類微生物的功能基因拷貝數大致在一個數量級水平；Clade A/Clade B介于0.77 ~ 13.35，表明Clade A的功能基因與Clade B的變化范圍較大；AOA、AOB與Clade A 的功能基因拷貝數的比值介于0.33 ~ 61.43。AOA、AOB與Clade B 的功能基因拷貝數的比值介于0.60 ~ 146.18。

圖3 不同圍墾年限Comammox amoA功能基因拷貝數

表 3 不同氨氧化微生物的豐度比值

2.6 氨氧化微生物豐度與土壤理化性質的相關性

對圍墾0、27、51、86 a的濕地土壤理化性質與氨氧化微生物豐度進行了相關性分析。由表4可見，AOB基因拷貝數與NH4+、NO– 3呈正相關，且與NO– 3含量達顯著水平；而Clade A和Clade B均與NH4+、NO– 3呈負相關，且與NH4+含量都達到顯著水平。推測全程氨氧化微生物(Clade A、Clade B)更適應于營養貧瘠條件，而AOB可能在活性氮源充足條件下主導硝化作用。TOC、NO– 2與AOA、Clade A、Clade B之間呈負相關關系，而與AOB呈正相關，且TOC與AOB、Clade A、Clade B的相關性達到顯著水平。4類氨氧化微生物的基因拷貝數均與pH呈正相關，且與AOA的相關性顯著。SO2– 4、EC與AOB豐度呈顯著負相關，與Clade B表現為顯著正相關。

表 4 氨氧化微生物豐度與土壤基本理化性質的相關性

注：* 表示相關性達< 0.05顯著水平。

3 討論

本試驗以長江口崇明島東灘濕地為對象來研究典型氨氧化微生物(AOB、AOA)與全程氨氧化細菌(Comammox)的分布及豐度特征，對了解長江口濕地生態系統中硝化作用微生物分布及數量特征具有重要意義。本研究中，不同圍墾年限(0、27、51、86 a)的濕地土壤中均檢測到全程氨氧化細菌，證實了全程氨氧化細菌存在于長江口崇明島圍墾稻田和自然灘涂濕地中。國外研究者基于宏基因組數據庫比對功能基因，推測全程氨氧化細菌廣泛存在于稻田土壤[3,5]、濕地[3]、淡水生態系統、工程環境[6]等。Wang等[2]發現不同地區自來水處理廠的樣本中Comammox豐度遠高于AOA和AOB的的豐度，達到2倍 ~ 5倍。不同圍墾年限的AOA、AOB與全程氨氧化細菌(Clade A或Clade B)的功能基因拷貝數的比值遠遠大于1(表4)，表明在此生境中經典氨氧化微生物比全程氨氧化細菌在數量上更具優勢。本研究的采樣區域為海陸交錯帶，其全程氨氧化細菌兩個分支Clade A與Clade B 的功能基因的檢測結果，對于揭示長江入海河口區域中是否存在全程氨氧化細菌可提供重要的參考數據。在本研究中，Clade A基因拷貝數與AOA、AOB的數量級相同，均為107copies/g，且Clade A與Clade B比值范圍為0.8 ~ 13.4，說明在長江口圍墾稻田濕地與自然灘涂濕地中全程氨氧化細菌主要以Comammox Clade A居多。萬琪慧等[15]在紫色水稻土中也檢測到Comammox Clade A和Clade B，且Clade A/Clade B比值范圍為16 ~ 34，表明兩個分支以Clade A為主，本試驗結果與此一致。新近，國外研究者在意大利農田土壤中檢測到了兩分支的Comammox豐度值均高于104genecopies/ng(以DNA計)，其中Comammox Clade A的基因拷貝數比Comam-mox Clade B高出2 ~ 3個數量級[6]，暗示了這些生境中Comammox Clade A在氮硝化過程中可能發揮著重要的作用。

通常認為，氮素含量豐富，且中性至堿性的土壤有利于AOB生長繁殖，施加氮肥的稻田土壤往往以AOB起主導作用進行硝化過程。鐘文輝等人[16]研究發現長期施用氮肥提高氨氧化細菌數量可能是施氮土壤硝化率和硝化勢較高的原因之一。本試驗中，相關性分析發現AOB與土壤TOC、NO– 3呈顯著正相關；隨著圍墾年限增加，硝化速率和AOB的基因拷貝數的變化趨勢一致，兩者呈顯著正相關，表明AOB對氨氧化過程起主導作用。黃蓉等[17]在提高酸性紅壤的pH后，發現AOB提高2個數量級，而硝化速率也顯著增加，本試驗結果與此一致。Comammox的基因拷貝數均明顯低于AOB，且與硝化速率呈顯著負相關，暗示了Comammox對硝化速率的相對貢獻較小。兩類全程氨氧化細菌即Comammox Clade A與Comammox Clade B有相似規律，未開墾灘涂濕地的基因拷貝數普遍高于圍墾稻田土壤，暗示這類微生物在灘涂自然濕地的氮轉化過程中可能起著重要的作用。

大量的研究結果發現，AOA比AOB對氨具有更高的親和力，因此當氨濃度很低時，AOA對氨的競爭遠勝于AOB。Martens等[18]發現在海洋中的AOA可以通過調整細胞機制在低于10 nmol/L的底物濃度環境中進行生長。最近的研究發現Comammox對氨的親和力大于AOA。本研究中，Comammox分支A和B(Comammox Clade A與Comammox Clade B)的A基因拷貝數與TOC、NH4+濃度均呈顯著負相關(表4)，推測在沒有圍墾的自然灘涂濕地中，TOC、活性氮含量少的貧營養環境可能更有利于Comam-mox的生長繁殖。

綜上所述，長江口濕地中檢測到ComammoxA基因，且與AOA和AOB共同生存，可能存在對底物和碳源的競爭。如要精確計算三者對表觀硝化速率的相對貢獻，需要進一步考察其RNA反轉錄、蛋白質等代謝水平[19]，進一步從宏基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組等方面探究其生理生化特性，從而可以準確評估其實際對硝化作用的貢獻率。

4 結論

1)本試驗在4種圍墾年限的稻田土壤中檢測到全程氨氧化細菌(Comammox)A基因，表明Comammox廣泛分布在該圍墾地區，且以分支Clade A為主。

2)未開墾灘涂濕地中Comammox Clade A 和Clade BA基因普遍高于圍墾稻田土壤。

3)半程氨氧化細菌(AOB)與硝化速率隨圍墾年限的變化一致，可能對硝化速率貢獻最大。

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Effect of Reclamation on Abundance of Comammox Microorganism in Chongming Wetland

SONG Yixuan1,2, JIN Rui1, ZHANG Xinlei1, ZHANG Jie1, JIA Zhongjun2, ZHANG Yaohong1*

(1 Nanjing University of Information Science and Technology, Collaborative Innovation Center for Forecast and Evaluation of Meteorological Disasters/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Agricultural Meteorology, Nanjing 210044, China; 2 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

The discovery of comammox broadens our understanding of the nitrification process, but little is known about its natural geographical distribution and its contribution to nitrogen conversion process. In this study, the surface soils of the paddy fields with different reclamation years (0, 27, 51 and 86 a) were selected in the Chongming wetland of the Yangtze River estuary, soil nitrification rates and its influencing factors were determined by aerobic incubation, and the target functional genewas analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR to analyze the quantitative variation characteristics of Comammox, ammoxidox bacteria (AOB) and ammonia archaea (AOA). The results showed that the net nitrification rates of paddy soils with 40, 75 and 120 a of reclamation were N 19.26, 11.63 and 11.43 mg/(kg·d), respectively, which were significantly 5.1-8.7 times higher than that of natural tidal wetland (<0.05). Thegene copy number of soil ammonia archaea AOA was between 0.34×107and 9.95×107copies/g, which increased significantly with the increase of reclamation year. Thegene copy number of soil ammonia bacteria AOB ranged from 1.14×107to 8.43×107copies/g, which was significantly positively correlated with soil nitrification rate (= 0.96*,<0.05), indicating that AOB might play a dominated role in nitrification process. The Comammox Clade A and Clade B copy number of the soils in the paddy fields (27, 51 and 86 a) were lower than that of tidal flat wetland soil (no reclamation), and Clade A increased significantly with the increase of the reclamation year. Comammox Clade A/Clade B was significantly negatively correlated with soil total organic carbon (TOC) and ammonium content (NH4+), indicating that the ammonia-oxidizing microbes (Clade A, Clade B) are more suitable for nutritional infertility. In summary, Comammox bacteria is widely present in the coastal wetland soils of the Yangtze River estuary, which possibly may play an important role in nitrogen transformation process of tidal flat natural wetlands.

Reclamation; Comammox; Ammonia oxidation

S154

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.06.014

宋怡軒, 金銳, 張鑫磊, 等. 圍墾對崇明東灘濕地全程氨氧化微生物的影響. 土壤, 2020, 52(6): 1196–1202.

國家自然科學基金項目(41671247, 41103039)，江蘇省自然科學基金項目( BK20171455) 和江蘇省大學生創新創業訓練計劃項目(201810300094X, 201710300018)資助。

(yhzhang@nuist.edu.cn)

宋怡軒(1995—)，女，四川南充人，碩士研究生，主要從事農業應對氣候變化研究。E-mail: 2287784164@qq.com