番茄紅素攝入與圍產期奶牛氧化應激和炎癥的關系

馬燕芬 寶 華 張春華 宋利文 鳳 英 羿 靜 高 民

（內蒙古自治區農牧業科學院，動物營養與飼料研究所，內蒙古呼和浩特010031）

圍產期是奶牛代謝性疾病和感染性疾病的高發階段，嚴重影響奶牛代謝狀況、機體健康、繁殖性能和生產性能。奶牛大約75%的疾病主要發生在泌乳啟動后的第一個月，泌乳早期出現的健康問題會持續很長時間，給奶牛業產生巨大的經濟損失[1-2]。目前已確定出圍產期奶牛健康失調與氧化還原失衡和免疫失衡有關[3-5]，也已確定出機體健康紊亂與炎癥反應增加密切相關[6]。具體來講，奶牛在泌乳啟動后由于采食量低下和機體代謝需求增加，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加。ROS 是線粒體能量代謝過程中產生的代謝產物，過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）作為過氧化物酶體也參與了ROS 的生成，并被引入到線粒體代謝過程中發揮氧化作用[7]。當超過機體耐受的ROS 不能被宿主抗氧化防御系統中和時，就會產生氧化應激[8]，而長時間的氧化應激是導致機體功能失調性炎癥反應的重要潛在因素，如乳房炎[3，9]。越來越多的研究表明，氧化應激主要是通過激活炎癥信號通路進而增加促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細胞介素-1β/6（interleukin-1β/6，IL-1β/6）的表達[10]，并最終導致奶牛乳腺產生炎癥反應和疾病[11-13]。因此，抑制氧化應激對預防炎癥反應和慢性疾病至關重要。目前在奶牛養殖過程中做到泌乳早期預防炎癥疾病發病的少之又少，大部分奶牛場是在奶牛發病后直接使用抗生素療法進行干預，而抗生素療法給奶牛業帶來的潛在危害是不可估量的。2020年7月1日我國已全面進入養殖端禁抗階段[14]，禁止在飼料中使用藥物飼料添加劑，而植物提取物類則仍可在飼料中使用。基于以上分析，尤其對于高產奶牛，圍產期日糧中添加植物源性抗氧化劑是清除體內多余自由基，降低機體氧化應激的有效途徑；也是降低由氧化應激導致組織、器官和細胞產生炎癥反應和機體損傷的有效途徑，且植物源性抗氧化劑具有成本低廉、來源廣泛等特點。番茄紅素是主要存在于西紅柿、木瓜、杏、粉紅葡萄柚、粉紅番石榴、西瓜等紅色水果和蔬菜中的一種天然類胡蘿卜素和類胡蘿卜素色素，具有抗氧化和抗炎癥作用[15]。本文將概述番茄紅素如何調節與圍產期奶牛疾病易感性相關的氧化應激和炎癥反應，以期推動番茄紅素及其制品在奶牛生產中的應用。

1 氧化應激與炎癥反應

奶牛在分娩后因能量需求超過能量攝入而使奶牛產生能量負平衡（Negative energy balance，NEB），長時間的NEB會導致奶牛產生代謝應激，并動員脂質進而產生ROS。當機體內氧化劑產生和抗氧化防御系統之間不平衡時，就會產生氧化應激，這種不平衡會改變細胞膜和細胞器，導致脂質和小分子氧化。當這種不平衡持續存在時，有機體的新陳代謝就會受到阻礙，這將會導致細胞損傷和/或功能障礙[16]，從而導致各種慢性疾病。早期研究認為氧化應激是奶牛疾病發病的原因[17]，現如今研究發現，氧化應激更多影響的是宿主的免疫系統和炎性應答，且體內體外研究證實圍產期奶牛氧化應激可能是炎癥應答系統和免疫系統紊亂的主要原因[18]，進而增加圍產期奶牛對疾病的易感性。因此，氧化應激被認為是連接奶牛代謝系統和免疫系統的紐帶。

1.1 氧化劑與炎癥反應

氧化劑包括介導敏感大分子氧化的自由基和非自由基分子，主要是ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），ROS和RNS是機體正常的代謝產物，又被稱為活性代謝物。ROS和RNS對信號傳導功能至關重要，而信號傳導功能又是細胞增殖、分化和代謝適應過程所必需的。如線粒體通過Krebs'循環和電子傳遞鏈產生三磷酸腺苷（ATP）時伴隨著超氧化物（O2-）和H2O2的產生，線粒體氧化磷酸化反應過程中，大約1%～3%的電子被轉移到O2中形成O2-[19]，生成的O2-被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）催化直接轉化為H2O2。O2-和H2O2通過氧化含巰基的半胱氨酸殘基，參與信號網絡中各種蛋白質如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的磷酸化[6]，MAPK信號通路是一個重要的炎癥信號通路。活性代謝物ROS 可激活MAPK 炎性通路[20]，進而激活炎癥信號通路核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），誘導NF-κB磷酸化和降解，并釋放p65 NF-κB進入細胞核激活NF-κB 通路，誘導多種炎癥因子（如TNF-α、IL-1β/2/6/18）的表達，介導機體炎癥反應[21]。

機體代謝需求增加（如奶牛妊娠期間）時，活性代謝物產量就會增加[22]；機體炎癥反應增加（如奶牛疾病狀態）時，活性代謝物產量也會增加，并會增加到先天性免疫功能和適應性免疫功能所需水平[3]。機體內源性細胞是將活性代謝物的積累限制在機體生理限度內，以防止細胞產生損傷；與內源性細胞生理作用相反，炎癥反應則是使機體內活性代謝物水平升高，并遠遠高于機體生理限度，如發生在急性大腸桿菌型乳房炎期間的脂質氧化，將會加重乳房炎發病程度，尤其是在奶牛泌乳早期[6，23]。因此，早期疏于預防，機體內產生的多余的活性代謝物將會加重炎癥性疾病的發病程度和發病長度。

1.2 抗氧化防御系統

抗氧化防御系統可以中和、代謝和延遲氧化劑的產生。抗氧化劑包括內源性酶，如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidases，GPx）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductases，Trx）、過氧化物酶（peroxiredoxins）、催化酶（catalases，CAT）、血紅素加氧酶（heme oxygenase，HMOX-1）和醌氧化還原酶1[NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]。日糧則是抗氧化劑來源的非酶庫，包括微量礦物元素（硒、銅、鋅）、多酚、維生素（vitamin A、C、D和E）、β-胡蘿卜素和番茄紅素[24]。酶和非酶抗氧化劑協同作用是有效防止活性代謝物損傷細胞的有效措施[3]。早期研究發現，將奶牛乳腺上皮細胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）和主動脈內皮細胞暴露于氧化劑中，就會增加活性代謝物的產生，損傷細胞并誘導細胞凋亡，補充非酶抗氧化劑硒[25-26]和植物多酚[20,27]則可激活內源性酶抗氧化劑而得到改善。此外，氧化劑O2-可在SOD 依賴于微量礦物質銅和錳的歧化作用下生成H2O2，H2O2在GPx 或硒依賴性GPx 和Trx 還原酶作用下還原為H2O 和O2，同時，還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）被氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），GSSG在GSH 還原酶的催化下又生成GSH。GSH 是一種抗氧化劑，可保護蛋白質分子中巰基免遭氧化，保護巰基蛋白和酶的活性。GSH還可用于GPx或Trx介導的新陳代謝[3]。因此，GSH和GSSG之間的平衡是至關重要的，因為GSH與GSSG的失衡可以改變細胞氧化還原平衡，導致氧化應激。還原型GSH能清除機體內預先形成的活性代謝物，并參與再生和維持其他抗氧化酶如維生素的功能。例如，細胞膜中脂質自由基中和過程中形成的氧化維生素E自由基被過氧化物酶利用GSH作為輔因子循環回還原維生素E。維生素E和硒等日糧微量營養素被認為是在機體代謝需求增加期間增強抗氧化防御機制和減少奶牛健康紊亂的重要工具[3,28]。

1.3 抗氧化應答基因通路與炎癥反應

抗氧化應答基因通路的激活是限制機體過度活性代謝物積累的另一個重要機制。核因子-E2 相關因子2（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NFE2L2）是一種重要的氧化還原敏感性轉錄因子，通過激活抗氧化酶和下游Ⅱ相解毒酶發揮抗氧化作用[29-30]。生理狀態下，NFE2L2與Kelch-Like-ECH Associated Protein 1（KEAP-1）結合處于靜態；在氧化應激時或NFE2L2激動劑存在下，NFE2L2與KEAP-1解離并易位進入細胞核，NFE2L2 激活抗氧化基因啟動子區的抗氧化應答元件（antioxidant response elements，ARE），進而激活下游抗氧化酶如SOD、GPx、Trx、CAT、GSH 和Ⅱ相解毒酶如HMOX-1 和NQO1 而發揮抗氧化作用[31]。李慧等[32]詳細闡述了NFE2L2 是如何調控抗氧化因子如HMOX-1、NQO1、SOD、CAT和GSH，這里不再贅述。氧化應激狀態下，ROS 激活MAPK 炎性通路參與調節NFE2L2 的磷酸化，ROS 主要是通過直接磷酸化NFE2L2或磷酸化中間激酶促進NFE2L2進入細胞核調節抗氧化目標基因及下游基因的表達[33]。NFE2L2對炎性反應也有非常重要的調控作用，如敲除NFE2L2后，奶牛乳腺上皮細胞[10]和腦組織[34]的氧化應激反應和炎癥反應會進一步增強，嚴重損傷神經系統功能；反之，增強NFE2L2 活性，可減輕氧化應激和炎癥反應，加快神經功能的恢復。因此，在氧化應激易發期，如奶牛圍產期間、患有乳房炎和子宮內膜炎在內的疾病期間，可通過調控NFE2L2 通路達到調控奶牛機體抗氧化和抗炎作用。此外，酶和非酶組分也可對整體細胞抗氧化功能共同起作用，這對于在炎癥性疾病期間抵抗細胞產生氧化損傷至關重要。

2 番茄紅素

近幾十年來，包括番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質等在內的類胡蘿卜素由于其抗氧化和抗炎作用在人類營養領域引起了極大的關注，類胡蘿卜素作為生物活性化合物被認為在預防人類疾病和保持良好健康方面發揮著重要作用，可以潛在地保護人類免受免疫應答、早衰、癌癥、心血管疾病和關節炎等疾病的影響。類胡蘿卜素是自然界中分布最廣、最普遍的脂溶性天然色素之一，存在于水果和蔬菜等植物的葉子、花、根和種子中，還存在于藻類、真菌、鳥類、甲殼類動物或昆蟲肉角質層中。與果肉相比，植物果皮渣中的類胡蘿卜素含量通常更高。它們不能被人或動物機體合成，只能通過飲食/日糧攝入補充。番茄紅素是最為常見的類胡蘿卜素之一。

2.1 番茄紅素的特性

番茄含有不同種類的具有抗氧化特性的化合物，如類胡蘿卜素、抗壞血酸、酚類化合物和α-生育酚。由于食用量高，番茄及其制品是人類飲食中類胡蘿卜素的主要來源。番茄紅素是一種天然胡蘿卜素和類胡蘿卜素色素，大量存在于如番茄、木瓜、杏子、粉色葡萄柚、粉色番石榴和西瓜等紅色水果和蔬菜中[15]。番茄紅素有11 個線性共軛雙鍵和兩個非共軛雙鍵，占完全成熟果實中番茄類胡蘿卜素總含量的80%以上。在所有類胡蘿卜素中，番茄紅素因其共軛雙鍵的長度，是一種強有力的單線態氧物理淬滅劑，其物理淬滅率是β-胡蘿卜素的2倍，α-生育酚的10倍[35]。番茄紅素通過緩解氧化應激、抑制炎癥細胞因子產生、減輕淀粉樣變性或淀粉樣斑塊的積累而表現出機體保護作用[36-37]，番茄紅素還可通過改善腸-肝-腦軸炎癥、改善糖脂代謝失衡、抑制凋亡和恢復線粒體功能而減輕機體缺陷[38]。

2.2 番茄紅素的抗氧化作用

目前有關番茄紅素在反芻動物上的研究報道逐年增加。奶畜在產仔后，因采食量低下和機體代謝強度增加導致乳腺組織產生過量的ROS誘發氧化應激，長時間的氧化應激又會誘發乳腺上皮細胞產生炎癥反應和凋亡[39]。氧化應激是由活性氧的形成和抗氧化防御的減少之間的不平衡引起的，這種不平衡通過細胞脂質、蛋白質和DNA 的氧化導致機體組織的實質性損傷[22，41]。因此，維持細胞內氧化還原平衡以降低氧化應激相關疾病的風險對圍產期奶畜來說是非常重要的，而提高奶畜乳腺組織的抗氧化能力可能是治療乳腺產生氧化損傷的有效方法。研究發現，番茄紅素是一種有效對抗反芻動物機體產生氧化損傷的潛在治療劑，番茄紅素的抗氧化潛力源于其直接清除活性氧和刺激內源性細胞防御系統的能力[41]。NFE2L2-ARE 信號通路在維持細胞氧化還原平衡中起著關鍵作用，也是維持細胞氧化還原平衡中非常重要的一條信號通路。本課題組研究發現，NFE2L2 參與促進奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化潛能，番茄紅素是一種非常有效的NFE2L2 激活劑，可激活NFE2L2 的表達進而激活NFE2L2-ARE 信號通路減輕機體產生的氧化損傷，且NFE2L2 的敲除可抑制番茄紅素的抗氧化作用，進一步表明NFE2L2 是上調抗氧化酶表達的中心[30，41]。氧化應激條件下番茄紅素可減弱自由基對奶牛乳腺上皮細胞核內NFE2L2 表達、ARE 熒光強度、II 相解毒酶HMOX1 和NQO1 的mRNA 表達水平、抗氧化酶SOD和GSH-Px 活性的抑制作用，清除奶牛乳腺上皮細胞中多余的自由基和ROS的積累，降低脂質過氧化和DNA 損傷而達到降低氧化應激，維持細胞內氧化還原平衡的目的[42-43]，進一步說明番茄紅素具有通過激活NFE2L2-ARE 抗氧化信號通路抑制氧化應激誘導的氧化損傷的潛力[44]。

2.3 番茄紅素的抗炎和抗凋亡作用

圍產期奶牛產生的氧化應激和慢性炎癥密切相關，長時間的氧化應激可誘發機體產生炎性反應，氧化應激和炎性反應協同作用又可導致健康障礙的慢性炎癥狀態永久化[22]。氧化應激和增強的全身炎癥反應是導致圍產期奶牛代謝性疾病和感染性疾病的常見誘因。過量的活性氧可以激活MAPK炎性通路和NF-κB炎性通路，進而增加促炎細胞因子的表達[45]，過度激活的MAPK炎性通路和NF-κB炎性通路又可導致炎性細胞因子表達的慢性增加[46]。研究發現，奶牛產犢后乳腺上皮細胞內TNF-α和其他促炎細胞因子表達的增強與大腸桿菌性乳房炎的嚴重程度有關[47]，也就是說氧化應激狀態下促炎細胞因子的增多可誘發大腸桿菌性乳房炎，而番茄紅素在氧化應激狀態下可失活MAPK炎性信號和NF-κB炎性通路的表達并降低促炎細胞因子TNFα、IL-6和IL-1β的表達，進一步表明番茄紅素在圍產期奶牛乳房炎的治療中也可能是有效的。

研究還發現，氧化應激除了激活MAPK和NF-κB炎癥途徑外，還可誘導細胞凋亡[48]。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）凋亡途徑在控制線粒體內在凋亡途徑中起著關鍵作用[49]。作為凋亡小體復合物的起始caspase 組分，caspase-9 可以被活性氧激活[50]，激活的caspase-9 可啟動下游caspase 級聯的caspase-3，進而導致細胞凋亡。此外，凋亡途徑還包括B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bax 家族蛋白。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，通過抑制氧自由基介導的膜損傷和穩定線粒體膜電位來防止凋亡[51]，Bax 是一種促凋亡蛋白，在調節細胞色素c釋放并促進細胞凋亡方面具有重要作用[52]。研究發現番茄紅素可下調氧化應激狀態下caspase-9、caspase-3 和Bax 的表達，上調Bcl-2 的表達，進一步證實了番茄紅素在控制氧化應激誘導的細胞凋亡中的保護作用。此外，研究還發現番茄紅素對NFE2L2抗氧化信號通路的激活減弱了圍產期奶牛乳腺上皮細胞的炎癥反應和凋亡[53]，而氧化應激狀態下敲除NFE2L2 因子，番茄紅素反而不能降低炎癥細胞因子的表達和乳腺上皮細胞的凋亡率，進一步證實了番茄紅素和NFE2L2 在圍產期奶牛的抗氧化反應中的直接作用。

綜上分析，番茄紅素主要是通過失活NF-κB 炎癥通路和caspase/Bax 凋亡通路降低促炎因子TNF-α和IL-1β/6的表達和細胞凋亡率而達到降低細胞炎性損傷，維持細胞內免疫平衡[10，43]。敲除NFE2L2后削弱了番茄紅素清除氧化損傷奶牛乳腺上皮細胞內ROS的積累、炎癥細胞因子的表達和凋亡的保護作用，這一事實進一步證明了抗氧化轉錄因子NFE2L2 對于番茄紅素在奶牛機體內發揮抗氧化作用機制是必不可少的[10，43]，也就是說番茄紅素主要是通過激活NFE2L2-ARE 抗氧化通路、失活NF-κB 通路和caspase/Bax通路進而激活下游抗氧化酶和II相解毒酶活性而發揮抗氧化作用、抗炎作用和抗凋亡作用[43]。

此外，研究發現番茄紅素還可通過降低體外培養系統中的應激反應來提高牛胚泡質量[54]，通過提高胚胎對氧化應激的適應能力而提高體外培養過程中牛胚胎的發育潛力[55]。盡管瘤胃微生物可能會代謝番茄紅素，但圍產期奶牛日糧中添加番茄紅素仍可通過瘤胃進入血液降低奶牛血清中脂質過氧化水平、提高總抗氧化能力[56]和調節抗氧化酶表達[57]而發揮一系列的抗氧化作用來調節奶牛泌乳早期的代謝適應性，提高奶牛產奶量和乳房健康，進一步證明了番茄紅素可添加到圍產期奶牛日糧中作為奶牛植物源性抗氧化劑的來源。有關番茄紅素在圍產期奶牛上發揮的更深入的抗氧化機制還需做進一步研究。

3 小結與展望

圍產期是奶牛機體健康、生產和盈利能力最為關鍵的時期。圍產期的生理變化通常會使奶牛更容易誘發代謝性疾病和乳房炎。乳腺上皮細胞作為乳腺抵御入侵病原體的第一道防線，并在感染開始時起主要作用。盡管與泌乳啟動相關的代謝需求的增加提高了泌乳早期奶牛的氧化應激狀態，但如果不加控制，長時間的氧化應激被認為是引發乳房炎等感染病的主要因素之一。且長時間的氧化應激會導致代謝應激奶牛的功能失調性炎癥反應。番茄紅素作為一種來源廣泛的具有生物活性的抗氧化劑，具有抗氧化作用和抗炎作用，番茄紅素的抗氧化作用不僅僅是通過激活NFE2L2-ARE 通路緩解奶牛氧化損傷的非常有效的活化劑，還具有調節參與細胞炎癥和細胞凋亡的氧化還原敏感分子信號通路途徑的作用。番茄皮渣是番茄紅素的重要來源，番茄皮渣作為番茄加工后的農副產品，有望作為圍產期奶牛日糧中的一種重要成分而對產犢后奶牛產生的氧化應激和慢性炎癥起到預防和治療作用。