白酒固態釀造中酵母種群結構和生態環境多樣性變化規律的研究進展

任妍菱 林 巧 趙樹東 楊柳煒 張婷婷 余 鑫

（西昌學院，四川西昌 615000）

目前，關于白酒發酵過程中酵母種類和酵母總數變化的報道中，酵母生態分布的變化和整個釀造過程中的種群結構尚不十分清楚。研究仍處于起步階段，白酒釀造是一種自然的多細菌固態發酵過程，酵母種群的挖掘有助于白酒固態發酵微生物的研究，對白酒質量、安全的提升具有重要意義；研究釀造環境中微生物組成結構有助于解析完全微生物的真實物種信息。同時，也能具體了解影響白酒發酵的環境微生物，為進一步分析酵母功能和選擇適合白酒釀造的優良酵母菌種奠定了基礎。

1 酵母種群結構

酵母是白酒生產過程中的主要功能微生物，如在淀粉糖化、酒精生成、芳香物質形成、糟醅發酵、成品質量等方面都起到重要作用。

羅方雯等研究結果表明，在醬香型白酒釀造過程中分離出的酵母包括復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、紅酵母屬（Rhodotorula）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、柯達酵母屬（Kodamaea）、拜耳結合酵母屬（Zygosaccharomyces）、南極假絲酵母屬（Pseudozyma sp）各1 種，隱球菌屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Torulaspora）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）各2 種，絲孢酵母屬（Trichosporon）3 種，維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）4 種，畢赤酵母屬（Pichia/Hyphopichia）6 種，假絲酵母屬等，得出釀造環境的特征性優勢酵母為W.anomalus、S.cerevisiae 和H.burtonii；醬香型大曲的特征性優勢酵母為W.anomalus 和S.fibuliquras，明確了醬香型大曲的優勢酵母菌結構。

李增勝等在研究清香型白酒的發酵過程中發現酒中的酵母主要是釀酒酵母屬，具有最強的酒精生產能力；其次是具有較弱酒精生產能力的漢遜酵母、假絲酵母菌和擬內孢霉；此外還有少量的畢赤酵母和產膜酵母。其中，釀酒酵母、漢遜酵母和內生孢子擬內孢霉均為無孢菌屬，釀酒酵母和內生菌屬；假絲酵母是鏈球菌科的一種，屬于半已知真菌。

崔小亮等研究結果表明，在濃香型白酒的生產過程中可以分離培養的酵母類型包括釀酒酵母、庫氏畢赤酵母、海洋嗜殺酵母、扣囊復膜酵母菌、拜氏接合酵母、半乳糖酵母、洛倫隱球菌。功能性酵母篩選結果表明，S.fibuligera WY 5-1 和S.cerevisiae WY 3-2 具有良好的乙醇生產特性。巴斯德畢赤氏酵母WY 6-3 和WY 9-2 具有良好的酯生產特性，溫度和pH 的耐受性為濃香型白酒在工業生產中選擇菌株提供了更多可能性。

2 酵母種群主要研究方法

2.1 傳統分離培養法

傳統分離培養法中最常見的是微生物平板培養法。該方法是利用營養成分不同的固體培養基分離培養可培養的微生物，并根據菌落的數量和形態確定微生物的數量和類型。分離和培養微生物的平板稀釋法是最普遍的操作之一，通常分為稀釋、接種、培養、計數幾個階段。但該方法存在許多不足，比如在選擇固體培養基和實驗室培養條件上都存在一定的局限性。

2.2 分子生物學技術

2.2.1 真菌內轉錄間隔區研究技術

在研究微生物環境和生態學方面，微生物群落的多樣性是研究重點。目前，宏基因組學在微生物多樣性研究中的應用已經引起了更多科研人員的關注。然而，對于同樣的樣本，宏基因組學研究通常占細菌種群的大部分，而真菌和其他微生物種類則遠遠落后。這對某些研究區域具有局限性，例如在釀酒過程中對微生物種群每個時期的探討。細菌的作用遠遠低于真菌，對酒的質量影響更大。因此，利用真菌獨特的內轉錄間隔區序列作為目標序列是富集復雜樣品中真菌DNA 的有利措施。

復合標簽技術及其在多樣本真菌高通量測序中的應用，可以提高樣本流速，有效降低高通量測序的成本，有效豐富樣本中的真菌種群。真菌種群為研究真菌多樣性提供了一種高通量的分析方法。

2.2.2 PCR-DGGE 技術

在分子生物學上，PCR-DGGE 技術是運用率最高的分析方法之一，作為研究環境微生物群落結構的重要手段，已被廣泛用于海洋和土壤微生物的研究當中。該技術準確度高、效能高、操作簡單，能清晰地說明樣本中微生物的多樣性，對微生物動態群落變化進行更加深入的了解。DGGE 方法使用聚丙烯酰胺中形成變性梯度和特異性引物，經PCR 擴增后得到長度一樣的靶片段。進行電泳時，GC 含量較低，變性后，以不同的遷移速率分離出不同GC 含量的核酸。

PCR-DGGE 技術的原理是從環境樣本中提取出DNA，通過PCR 的擴增獲得更多相同長度、不同序列的基因片段。DNA 中4 個堿基排列方式和組成的差異會導致序列不一樣的雙鏈DNA 分子融化時冷熱程度有所差異，然后通過梯度凝膠電泳變性時構成不同的條帶，并且與DGGE 指紋圖譜進行比較，可以得到微生物的群落結構的總體資料。

2.2.3 高通量測序技術

高通量測序技術是可以進行深刻而透徹測序的下一代測序方法，可以同時分析幾十萬到幾百萬個DNA 分子的序列，通常是非常短的長度，允許對一個物種的轉錄組和基因組進行精確深入的研究。當前這種測序技術設計出了第二代和單分子測序技術，主要是Roche 454 的GSFLX 平臺，ABI 的SOLID 測序平臺和Illumina 的SolexaGenomeAria。1yzer 測序平臺。第二代測序技術具有高通量、重復性好、精確度高、無需構建文庫、無克隆錯誤、最大限度地節省人力和物力等優點。其中，Roche 454的原理是依靠酶級聯生物發光反應進行DNA 序列分析。DNA 聚合酶、三磷酸腺苷、熒光素酶和二磷酸酶共同作用，聚合每個引物的dNTP 并發出熒光信號。對熒光信號的存在情況以及強度大小的檢測，DNA 序列可以得到確定。Solexa 測序原理是橋式PCR，合成測序和可逆終結者。dNTP 與熒光標記的dNTP 通過酶催化串聯反應直接連接，在合成或連接過程中形成互補鏈。將捕獲的光信號轉換成序列峰，得到互補的鏈序列信息。Abi-solid 測序的原理是根據大規模的磁珠平行克隆和DNA 連接的測序，通過連接酶檢測寡核苷酸上的熒光團。

3 環境對酵母的影響

環境的改變會導致酒醅中初始微生物結構的差異，進而導致微生物種群演替差異，其中酵母的種群結構也會受到影響。

3.1 高溫環境

對于酵母耐熱機制的研究，早期主要集中在比較生物學上。酵母質膜的流動性在高溫下會受到影響。當溫度太高時會造成膜紊亂以及造成蛋白質的變性，抑制糖酵解并增加突變。同時，質膜的滲透性得到增加，從而質子流增加。高溫對酵母細胞也有。溫度越高，越容易引起酵母過早衰老和死亡，從而使細菌占主導地位。溫度通常會導致酵母細胞中各種成分的變化，例如脂肪酸、磷脂、麥角固醇等。

3.2 低溫環境

在溫度較低時酵母具有更高的糖吸收能力，緩慢的糖酵解作用，使海藻糖、糖原和其他儲備糖的合成增加，HOG-MAPK 途徑被激活，甘油產量增加。溫度過低時會導致酵母對氮喜好程度的改變，使NCR 系統的效率下降，并影響可滲透酶的活性和氮的吸收。降解代謝途徑在低溫發酵中期和后期涉及到氨基酸代謝的基因表達會增強。低溫主要通過減少鏈長和增加中鏈脂肪酸來改善膜的流動性，從而影響酵母細胞膜的脂肪酸組成。低溫對氮代謝、酵母糖代謝和脂質代謝的影響可以更好地改善酒的感官品質。

3.3 耐酸環境

酯的生產能力是判斷酵母性能的重要指標，特別是在低pH 值的環境中，具有優異性能的細菌可以發揮其優勢。隨著醋酸發酵，醋醅酸度和溫度持續上升，酒精含量不斷下降。酸度阻礙酵母的生長和發酵。

3.4 無機鹽和礦物質對酵母的影響

在生長過程中，微生物需要無機鹽來保持細胞的滲透壓，各種礦物質元素，如鈣、鐵、鋅、錳等對酶的功能和酶活性也有重要影響。華艷艷等研究表明，向種子培養基中加入錳可以改變細胞的形態，可以提高紅發夫酵母中D-葡萄糖苷酶的活性；向發酵培養基中添加0.1 g/L Mn2+可顯著促進細胞生長和蝦青素合成。吳澤柱等試驗結果表明，優化培養基中的營養成分可以有效提高酵母的發酵能力。邊芙蓉等研究表明，添加一定量金屬離子對增加谷胱甘肽產量有很好的作用。

3.5 培養基中各營養組分對酵母發酵的影響

邢建宇等研究表明，蛋白胨和酵母膏顯著提高了釀酒酵母細胞密度、乙醇耐受性和發酵能力，其中酵母提取物的作用更大。最終，在培養時通過乙醇沖擊試驗，得出酵母提取物含量高的培養基能夠有效復原酵母對乙醇沖擊的生長和繁殖能力，有效適應高濃度酒精環境。

4 不同酵母之間的相互作用

4.1 釀酒酵母和異常漢遜酵母兩者之間的相互作用

顏兵等通過研究證明釀酒酵母發酵產生的代謝產物抑制了異常漢遜酵母的生長發育。通過試驗發現，在與釀酒酵母混合培養期間，異常漢遜酵母被顯著抑制。通過對營養液、酒精、pH 等因素的研究，得出在無細胞濾液中，異常漢遜酵母的生長發育被顯著抑制，但是釀酒酵母的生長一切正常，這說明異常漢遜酵母的生長和發育會受到釀酒酵母代謝產物的抑制作用，而不受其他因素的影響。

4.2 釀酒酵母和地衣芽孢桿菌二者作用

凌杰等研究結果表明，釀酒酵母對地衣芽孢桿菌的生長存在一定的抑制性，而高溫會削弱釀酒酵母的抑制作用。原因如下：首先，地衣芽孢桿菌的生長會受到釀酒酵母產生的一些大分子蛋白質的影響。其次，因為釀酒酵母在生長發育過程中會產生酸，從而降低了環境的pH 值，對地衣芽孢桿菌的生長有一定抑制。當沒有酵母細胞在環境中存活時，地衣芽孢桿菌會讓這種抑制作用逐漸減弱并趨于正常生長狀態。這一發現在有效控制白酒的產量和質量方面起著重要作用。

4.3 乳酸菌與酵母菌之間的作用

熊君燕等研究結果表明，以還原糖消耗率作為酵母菌產乙醇和乳酸菌產有機酸的主要指標，在乳酸菌和酵母菌的共培養條件下，乳酸菌對3 種酵母菌生長有不同程度的抑制，對S.Cerevisiae YJ1 產乙醇抑制作用最大，對C.aaseriMJ7 和P.kudriavzeviiMJ14 產乙醇影響很小。對乳酸菌而言，P.KiavzeviiMJ14 對乳酸菌具有抑制作用，而對P.sp.JYA1 和L.Plantarum JMRS4 產乙酸起促進作用。就代謝產物而言，L.1actisJMRS1-2 和L.plantarum JMRS4 分別是產乙酸和乳酸的主要菌株。

4.4 釀酒酵母和畢赤酵母之間的作用

陳景樺等研究成果表明，在混合發酵過程中，釀酒酵母和畢赤酵母的酯酶活性得到適當提高。當白酒中酯類的含量增加時，白酒的香氣會增強。當巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母在混合酒精發酵過程中，琥珀酸、乙酸、甘油和揮發性酸的產生與酵母細胞的生長呈正相關。當酒精發酵過程中的酵母數達到平衡階段時（6 d～10 d），混合發酵過程中產生的甘油、琥珀酸、乙酸和揮發酸含量最高。與釀酒酵母相比，混合發酵過程中的乳酸和琥珀酸含量基本保持不變，揮發酸含量呈下降趨勢，但甘油含量明顯增加，這表明釀酒酵母和發酵畢赤酵母混合發酵對酒的酸度沒有顯著影響，但混合過程中提高酒的質量可以通過增加甘油含量來實現。

5 酵母菌演替規律

楊建剛等研究，得出的結論是，第0 天，酒窖中的主要酵母類型為C.rugopelliculosa、S.termentans、N.castellii、T.delbrueckii 和S.cerevisiae；在第4 天，酒窖中的酵母數量非常豐富，其中占優勢的酵母為T.delbrueckii，N.castellii，S.cerevisiae 和P.membranifaciens。在第8 天，酵母數量增多，但是酵母的種類逐漸減少。酵母的主要類型是釀酒酵母，而C.humilis 和K.exigua 是主要的酵母。經過12 d 的試驗，發現隨著酒窖環境的變化，酵母菌的數量和類型同時減少。在此階段，酒窖中的酵母主要是卡氏酵母和釀酒酵母。到20 d～30 d，隨著酒窖pH 值的降低和乙醇含量的增加，釀酒酵母已成為酒窖中的主要菌株。在第44 d，發酵已經結束，但酒窖中的酵母數量很少，酵母種類趨于多樣化。

6 結論

目前，白酒的生產仍采用傳統發酵工藝，這種生產方法具有很強的不確定性和經驗性，不能準確地控制白酒的生產。如何在傳統生產工藝的基礎上建立穩定的生產安全保證體系，并且要維持“手工創造的高貴品質”，建立完整穩定的質量安全體系，是目前所有白酒生產企業面臨的困難和機遇。因此，研究固態發酵白酒中酵母菌種群結構和多樣性的變化規律，利用酵母菌種群的優勢對提高白酒的質量和品質，提高低濃度白酒的穩定性以及確定白酒酒齡等具有重要意義。