骨髓間充質干細胞來源外泌體Zeb2在大鼠缺血性腦損傷后的表達及其意義

尚欣穎，張瑋

昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650032

卒中是導致我國居民死亡的主要原因之一［1］，其中急性缺血性腦卒中（AIS）占卒中患者的絕大多數［2］。重組組織型纖溶酶原激活劑或尿激酶靜脈溶栓治療和血管內機械取栓是目前臨床推薦的AIS 治療方法，但嚴格的入選標準和禁忌證限制了該方法在臨床實踐中的應用范圍［3-4］，導致很多患者遺留下嚴重的神經功能缺陷。因此，探求新的安全有效的治療方法十分必要。近年來，骨髓間充質間充質干細胞（BMSC）作為一種治療神經系統疾病的新方法得到關注，其通過釋放外泌體將各種生物活性分子從供體細胞轉移到受體細胞從而發揮作用［5-6］。鋅指E盒結合同源盒2（Zeb2），又稱SMAD 相互作用蛋白-1（SIP1）或ZFHX1B，是一種DNA 結合轉錄調控因子，參與大腸癌、乳腺癌、Mowat-Wilson 綜合征等疾病的發生以及神經細胞增殖、分化、存活、凋亡等重要生物學過程［7-8］，但其對缺血性腦卒中后的神經保護作用還未見報道。本文通過構建大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，檢測其BMSC 及其外泌體Zeb2基因相關表達情況，并探討缺血性腦損傷與Zeb2 的關系，從而為缺血性腦卒中的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF 級SD 雄性成年大鼠18只，體質量250～350 g，由昆明醫科大學實驗動物學部提供，均分籠飼養在通風良好、水和食物充足的恒溫環境中。試劑及儀器：佳靈線栓購于廣州佳靈生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司，Zeb2 抗體購自英國Abcam 公司，β-actin 抗體購自上海AbMART 公司，HRP 標記通用型二抗（goat 來源）購自德國CST公司。外泌體提取試劑盒購自廣州銳博公司，無外泌體血清購自上海VivaCell 公司，PVDF 膜購自購自Millipore 公司，應用Beacon Designer7.90 設計引物，實時熒光定量PCR 儀購自西安天隆公司，超低溫冰箱（-80 ℃）購自美國Thermo公司等。

1.2 大鼠大腦中動脈缺血再灌注（MCAO）模型制備及分組 將18只6～8周齡的SD雄性大鼠隨機分為假手術組和MCAO 模型組各9 只，MCAO 模型為模擬人類缺血性腦卒中的常用模型。將模型組SD成年大鼠以1 mL/300 g 劑量腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，麻醉后固定小鼠，碘伏消毒后取頸部正中切口約1.5 cm。暴露右側頸三角后分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），用3-0 縫合線將右側CCA 扎閉，在距CCA 分叉1 cm處打一松結備用，再用3-0 縫合線將ECA 扎閉（盡量靠近CCA 分叉處），用微血管夾夾閉ICA。在CCA備用線近心端2 mm處用顯微剪開一個小口，插入佳靈線栓，系緊松結。移去ICA 的微血管夾，調整方向，將線栓插入ICA，當感到有阻力時，停止進線栓。將剪口處松結打死，剪去多余的線栓，縫合2～3 針，防止大鼠醒時線栓脫出。缺血2 h后，異氟烷氣體麻醉拔出線栓，待大鼠蘇醒后放回籠內飼養。假手術組僅結扎ICA，不阻塞大腦中動脈，造成與模型組同樣的手術損傷。

1.3 神經功能學評分 再灌注24 h 后，采用Bederson 方法對神經功能缺陷進行評分［9］。具體標準為：0分表示神經功能沒有缺失、1分表示向左側前肢內向屈曲、2 分表示向左側行走、3 分表示以追尾狀的形式向左側轉圈。高于1分的大鼠參與后續實驗。

1.4 BMSC 細胞培養及外泌體提取 神經功能學評分結束后，立即麻醉后快速脫頸法處死大鼠。無菌條件下將股骨完整的剪下放入盛有DMEM/F12基礎培養基的培養皿內，用2.5 mL 注射器吸取DMEM/F12 培養基后將骨髓從骨髓腔內沖出，沖至股骨變白為止。隨后用移液器吹打至單細胞懸液，1 000 r/min 離心3 min 收集細胞。用5 mL DMEM/F12 完全培養基重懸細胞后接種至T25 瓶內，37 ℃5% CO2培養箱內進行培養。接種24 h 后部分細胞貼壁，貼壁細胞呈圓球狀，未長出形態，培養液中有大量未貼壁細胞，換液后繼續培養。3 d時細胞開始長出形態但未完全長開，細胞呈梭型生長；5 d 時所有細胞都已經長出形態，細胞形態伸展，呈梭型生長，融合度50%左右；7 d 時細胞融合度達到70%左右；10 d 時細胞融合到90%以上，細胞狀態良好，胞體透亮，折光性良好，細胞呈放射狀或漩渦狀生長，0.25%胰酶消化傳代。傳至第2、3 代時絕大部分的造血干細胞已經除盡，可以進行實驗。細胞傳代時，用于后續提取外泌體的細胞，待細胞過夜培養后，更換為不含外泌體血清的完全培養基培養24 h。收集細胞上清和血清分開于2 支15 mL 離心管離心，室溫2 000 g 離心30 min 分別去除細胞上清和血清中的細胞碎片及雜質。離心后更換至相應的10 mL 離心管，每管加入1/3 體積的銳博外泌體提取試劑，混勻后4 ℃冰箱放置過夜，1 500 g 4 ℃離心30 min，棄上清，管底灰白色沉淀即為外泌體。

1.5 Zeb2 mRNA 檢 測 采 用RT-PCR 法。 在Pubmed 上查詢SD 大鼠的目的基因Zeb2 mRNA 序列，以CDS 序列設計引物。應用beacon designer7.90 設計Q-PCR 引物，采用RNA 提取試劑盒提取兩組經處理過BMSC、BMSC 外泌體及血清外泌體的總RNA，取3 μL 總RNA 樣品在ND-1000 分光光度計中測其濃度。按照合成20 μL cDNA 需要總RNA樣品為2 μg計算所需總RNA的體積計算，逆轉錄中所需總RNA 的體積量=1μg/測得的RNA 濃度。先按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明合成cDNA 第1 條鏈，再根據SYBR Green qPCR試劑盒說明書，以β-actin為內參，以cDNA第1鏈為模板進行PCR 反應，95 ℃預變性10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s為反應條件進行40個循環，采用公式2-ΔΔCt計算各組β-actin和Zeb2基因表達量。

1.6 Zeb2蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。收集經處理過的細胞，PBS 洗滌細胞后加入RIPA 裂解液離心后制備BMSC 蛋白樣品，然后根據BCA 試劑盒說明書操作進行蛋白濃度測定。SDS-PAGE 電泳后采用濕轉法轉膜到PVDF 膜上，將PVDF 膜置于5%牛血清白蛋白室溫20～30 ℃封閉1 h 后，用1∶1 000稀釋過的一抗Zeb2抗體、β-actin抗體在4 ℃冰箱中過夜；取出雜交袋，室溫復溫10 min，去除一抗液體，緩沖液洗膜3次，加入稀釋好的二抗（1∶2 000）避光室溫孵育2 h；采用ECL 顯色，凝膠成像儀曝光觀察并拍照，最后采用Image J 對蛋白條帶灰度進行定量分析。BMSC 外泌體和血清外泌體提取完成后進行外泌體蛋白濃度測定，其余步驟如上。

1.7 統計學方法 采用SPSS25.0 進行數據統計分析，計量資料符合正態分布以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組神經功能學評分結果的影響 缺血再灌注24 h后分別測假手術組和模型組的神經功能缺陷評分，假手術組神經功能缺陷評分為0分，模型組神經功能缺陷評分為（2.67±0.51）分，兩組差異具有統計學意義（P＜0.05）；表明成功構建了大鼠MCAO模型。

2.2 兩組Zeb2 mRNA 表達 假手術組BMSC、BMSC 外泌體及血清外泌體Zeb2 mRNA 的相對表達量分別是1.35±0.30、1.09±0.11、1.11±0.48；模型組BMSC、BMSC外泌體及血清外泌體Zeb2 mRNA的相對表達量分別為15.00±2.43、10.34±3.36、7.48±2.35。與假手術組比較，模型組BMSC、BMSC 外泌體及血清外泌體Zeb2 mRNA 相對表達量呈上升趨勢，兩組差異具有統計學意義（P均＜0.05）。

2.3 兩組Zeb2 蛋白的表達 缺血再灌注處理后，模型組BMSC、BMSC外泌體及血清外泌體中Zeb2蛋白的相對表達量依次為1.03 ± 0.13、1.08 ± 0.15、1.12±0.17；假手術組的Zeb2 蛋白相對表達量分別為0.71 ± 0.10、0.74 ± 0.14、0.76 ± 0.10。兩組相比，模型組BMSC、BMSC 外泌體及血清外泌體Zeb2蛋白表達水平呈明顯上升趨勢，兩組差異具有統計學意義（P均＜0.05）。

3 討論

缺血性腦卒中主要是由大腦動脈閉塞，患者腦組織出現局部或大面積缺氧缺血，發生神經元細胞凋亡和腦組織壞死，是世界范圍內神經系統常見的高發病率、高病死率和高致殘率的疾病之一［10-11］。因此，尋找新的治療策略，保護受損的神經細胞和神經功能，防止缺血性腦卒中急性期腦組織再灌注期損傷有重要意義。

由于腦部特殊的解剖結構及中樞神經系統的復雜性，在治療缺血性腦卒中時往往要考慮藥物是否能有效到達腦組織。BMSC 是一種成熟的多能干細胞，可分化為多種類型的細胞，包括脂肪細胞、軟骨細胞、神經和肝細胞等［12］。既往研究發現，BMSC 可通過促進血管生成、神經再生和髓鞘形成等途徑改善腦卒中后的神經功能預后，BMSC 移植治療腦卒中有肯定療效。但是，由于BMSC 移植后出現并發癥如細胞免疫排斥反應、使用前的儲存問題及致瘤性等問題的困擾，BMSC 療法受到較大限制［13］。近年來研究表明，BMSC 細胞移植治療腦卒中最有可能通過旁分泌機制發揮作用，而在BMSC 的衍生分泌物中，外泌體已經引起了大家廣泛的研究興趣。外泌體是一種直徑30～100 nm 的微小膜泡，內含多種mRNA、DNA、蛋白質等生物活性物質，具有跨越血腦屏障及血腦脊液屏障的能力。同時，有研究表明BMSC 來源的外泌體對急性缺血性腦卒中康復的治療效果與BMSC 的治療效果相當，這說明是BMSC來源的外泌體，而不是BMSC，參與缺血性腦卒中后相關基因調控及其功能表達的過程［14-15］。

Zeb2 在分離編碼能與異源表達的非洲爪蟾Smad1（XSmad1）的MH2 結構域結合蛋白過程中首次發現［16］。研究表明，在脊髓損傷或急性缺血性腦卒中小鼠模型星形膠質細胞中，Zeb2 的靶向敲除可減輕星形膠質細胞增生，增加病變面積，并損害運動功能的恢復［17］。有研究者指出，Zeb2 是神經元發育中起重要的轉錄因子，Zeb2突變會導致莫瓦特-威爾遜綜合征，此時個體表現出多種嚴重的神經發育缺陷，如小頭畸形、癲癇、運動發育遲緩等［18］。因此，為了從細胞水平研究Zeb2 對缺血性腦損傷的神經保護作用，我們構建了活體大鼠MCAO模型，缺血再灌注24 h 后取大鼠股骨骨髓進行BMSC 原代培養及其外泌體提取，同時取血液離心獲取血清，提取血清中的外泌體，再采用RT-PCR、Western blotting 方法檢測假手術組和模型組BMSC、BMSC 外泌體、血清外泌體中Zeb2 mRNA、蛋白表達情況，顯示模型組BMSC、BMSC 外泌體及血清外泌體Zeb2 mRNA、蛋白表達水平明顯上升，說明在腦損傷后機體可能會通過刺激Zeb2 的表達從而達到神經保護的作用。同時提示我們，通過調控BMSC 來源外泌體中Zeb2 表達水平進行急性缺血性腦卒中的治療可以作為未來研究方向。此外，Zeb2在腫瘤發生的上皮細胞-間充質轉化過程中也起著關鍵的調節作用，可激活細胞增殖、遷移和侵襲能力［19］，如MicroRNA-545 通過靶向負調控Wnt/β-catenin 通路中Zeb2 的表達抑制非小細胞肺癌的發展［13］。有研究表明，Zeb2 通過激活smad7 抑制β-catenin 對少突膠質細胞前體細胞的負調節，從而促進少突膠質細胞的分化，參與中樞神經系統的髓鞘形成以及髓鞘損傷修復［20］。因此，我們推測BMSC 來源外泌體Zeb2 可能通過參與Wnt/βcatenin通路影響缺血性腦卒中后的恢復過程。

綜上所述，BMSC 及外泌體Zeb2 基因在大鼠缺血再灌注損傷后的表達明顯上調，說明Zeb2 可能具有神經保護的作用，提示BMSC 來源的外泌體Zeb2可能成為人類缺血性腦卒中疾病潛在的診斷和治療靶點。