生育三烯酚抗骨質疏松癥分子機制的研究進展

楊艷，彭雅茗，崔佳樂，林靜，于瀾，周廣舉

川北醫學院附屬醫院，四川南充637000

骨質疏松癥是多種原因引起的與年齡相關的一種全身性骨骼疾病，由于骨量下降和骨組織微結構破壞導致了骨骼脆性增加和骨折風險增大，即使輕微的創傷或無外傷的情況下也容易發生骨折［1］。我國是世界上老年人口最多的國家之一，預計到2050年我國骨質疏松癥患者將達到1.2 億［2］。隨著全球人口老齡化問題日益突出，骨質疏松性骨折在55歲以上的女性和65歲以上的男性中越來越常見，且骨折風險的增高幾乎累及全身所有部位的骨骼；骨折導致老年人生活質量下降，身心健康受損。骨質疏松癥的傳統藥物治療不良反應較明顯，如激素替代療法與心血管疾病和乳腺癌的風險增加相關，雙膦酸鹽可能引起下頜骨壞死，特立帕肽可能增加患骨肉瘤的風險［1，3］。目前對骨重塑更具特異性且不良反應較小的新型藥物（如硬化蛋白抑制劑、組織蛋白酶K 抑制劑、靶向WNT 抑制劑等）研發雖然已經取得了很大進展［3-4］，但這些藥物價格昂貴且療效尚不確切。大量研究表明，生育三烯酚具有抗骨質疏松特性，現就其發揮作用的可能分子機制綜述如下。

1 生育三烯酚與骨質疏松癥

生育酚和生育三烯酚二者同屬于維生素E 家族，根據側鏈上的結構差異及母核上存在的甲基位置不同，每種同工型又可進一步分為α、β、γ、δ 四種亞型。在自然界中，玉米油和橄欖油中富含生育酚，其中α-生育酚是維生素E最主要的成分；米糠油、紅棕櫚油、大麥主要含生育三烯酚，其中紅棕櫚油維生素E 富含的生育三烯酚達75%，胭脂樹種子更是富含90%的δ-生育三烯酚和10%的γ-生育三烯酚［5］。生育三烯酚具有抗氧化應激、抗炎、降膽固醇和抗腫瘤等多種生物活性。大量研究表明，生育三烯酚作為單一異構體或者混合物形式均顯示出強大的抗骨質疏松特性，而生育酚在抗骨質疏松方面的相關研究結果則不一致。在骨質疏松動物模型中，生育三烯酚可預防和改善雌激素缺乏（卵巢切除術）、睪丸激素缺乏（睪丸切除術）、尼古丁、乙醇、糖皮質激素、代謝綜合征、氧化應激、糖尿病等因素所致的骨質疏松［6-8］，此外，生育三烯酚也可促進正常大鼠骨形成。在骨重塑中，破骨細胞和成骨細胞的分解和重建有助于維持骨的質量和穩定性。骨重塑過程包含三個階段，破骨細胞骨吸收激活，骨骼從分解代謝轉換為合成代謝，成骨細胞修復新骨后終止［9］。骨重塑過程異常常導致代謝性骨病如骨質疏松癥。生育三烯酚可通過抗氧化應激、抗炎、抑制甲羥戊酸途徑、抑制破骨細胞分化、促進成骨相關基因的表達等多種途徑影響骨重塑過程，從而保持骨骼的完整性。

2 生育三烯酚抗骨質疏松的分子機制

2.1 抗氧化、清除自由基 氧化應激是指機體組織或細胞內氧自由基增多且清除能力降低導致活性氧自由基（ROS）在體內或細胞內蓄積引起的氧化損傷過程。骨質疏松癥形成的一個重要因素是負責合成骨基質的成骨細胞數量和活性下降以及成骨細胞中核因子-κB（NF-κB）配體受體激動劑的表達增加介導破骨細胞數量和活性增加所致，這在一定程度上與ROS 的產生增加超過體內生理量及抗氧化劑防御系統降低有關。過量的ROS 通過增加NF-κB 受體活化因子配體（RANKL）的產生和激活NF-κB 介導的炎癥反應來促進破骨細胞生成并抑制其凋亡［10］。ROS 增多可引起叉頭框蛋白O（FoxO）與Wnt通路競爭性結合β 連環蛋白（β-catenin）增強，從而將胞內有限的β-catenin 從T 細胞因子/淋巴細胞增強因子轉錄轉移到FoxO 轉錄，導致成骨細胞的生成和增殖分化減少，降低骨形成［11］。另外，脂質過氧化作用的增強激活過氧化物酶增殖活化受體γ，導致骨髓間充質干細胞的成脂分化增強而成骨分化受到抑制［12］。生育三烯酚分子中含有不飽和雙鍵，是一種脂溶性酚類抗氧化劑，可降低細胞ROS 水平，還可激活抗氧化酶和抵御氧化應激對成骨細胞的損害來提高成骨細胞的分化和活性。最近一項體外研究發現，δ-生育三烯酚對MC3T3-E1細胞氧化損傷的保護作用是通過降低細胞內ROS 水平和增加GSH/GSSG 比值實現的，此外該過程還與PI3K/Akt-Nrf2信號通路之間的相互作用有關［8］。有學者研究了不同濃度γ-生育三烯酚對暴露在過氧化氫中的成骨細胞脂質過氧化、抗氧化酶活性及細胞凋亡的影響，結果證實γ-生育三烯酚以濃度依賴方式防止丙二醛升高，增加了超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性，減少了成骨細胞凋亡，但高濃度會引起成骨細胞毒性，加速細胞凋亡［13］。此外，最新臨床研究表明，在連續12 周補充生育三烯酚（430 mg/d 或860 mg/d）治療的89 例絕經后骨質疏松癥女性中，其骨吸收生物標志物如尿液N 端端肽（NTX）、血清可溶性RANKL（sRANKL）及sRANKL/骨保護素（OPG）比值，以及氧化應激的生物標記物如8-羥基2＇-脫氧鳥苷均明顯降低，而血清特異性堿性磷酸酶/NTX 比率顯著增加，骨吸收受到明顯抑制［14］。

2.2 抑制炎癥反應 既往研究表明，骨質疏松癥和炎癥密切相關，炎癥是機體組織對損傷因子產生的一種防御反應，導致免疫細胞因子產生。炎癥反應在消除受損骨組織和骨組織修復中起重要作用。但是，炎癥反應的持續又會反過來抑制骨形成并激活骨吸收。炎癥因子不僅可以刺激破骨細胞增殖和分化，還會進一步提高破骨細胞活性，加速骨基質降解，增加骨組織再吸收［6-7，15］。IL-1、IL-6、TNF-α 等炎癥細胞因子均參與誘導破骨細胞生成［16］。TNF-α和IL-6在骨組織中與其特異性受體結合后引起成骨相關的基因表達下調，其部分是通過激活信號轉導子和轉錄激活子抑制絲裂原激活的蛋白激酶活性以及通過泛素連接酶SMAD 泛素化調節因子1（SMURF1）和SMURF2 起作用的，部分是通過激活NF-κB 起作用；炎癥細胞因子與其受體相互作用也會增加成骨細胞產生巨噬細胞集落刺激因子和RANKL，進一步促進破骨細胞分化、增殖和存活［17］；此外，促炎細胞因子還可上調Dickkopf 相關蛋白1和硬化蛋白，從而抑制成骨分化的關鍵途徑即Wnt/β-catenin信號通路［17］。在破骨細胞前體細胞或破骨細胞中，TNF-α、IL-1、IL-6 通過NF-κB、MAPK 和Janus激酶-STAT 等信號通路發出信號，上調破骨細胞相關基因表達從而促進破骨細胞生成［17］。生育三烯酚具有抗炎活性，可以減少全身炎癥反應而具有骨保護作用。研究發現，生育三烯酚處理可降低2 型糖尿病小鼠的炎性細胞因子（如IL-2、IL-23、TNF-α）水平，促進骨骼健康［6］；與對照組相比，生育三烯酚處理可明顯降低代謝綜合癥引起的骨質疏松小鼠體內IL-1、IL-6、TNF-α的水平，表現為處理組的骨小梁微結構的得到明顯改善［16］。尼古丁可刺激IL-1、IL-6 等細胞因子產生。在尼古丁誘發的骨質疏松模型中，破骨細胞數量增加，成骨細胞數量減少，骨形成速率降低，而補充生育三烯酚治療后可逆轉這種有害的骨骼改變［18］。還有研究發現，生育三烯酚可顯著降低去卵巢大鼠血中骨鈣素、IL-1和IL-6水平，減少與雌激素缺乏有關的高骨轉換率，增加骨小梁體積和小梁數目［19］。

2.3 抑制甲羥戊酸途徑 甲羥戊酸途徑是真核細胞中保守的代謝通路，控制膽固醇的生物合成。研究表明，甲羥戊酸途徑與骨代謝有關，主要是通過激活鳥苷三磷酸結合蛋白（GTPase）調節成骨細胞和破骨細胞的生成，促進骨質流失［20］。甲羥戊酸抑制劑（如他汀類藥物）可增加骨礦物質密度并降低骨折風險，可用于骨質疏松癥的治療［21］。他汀類藥物是一種已知的3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶抑制劑，它通過抑制甲羥戊酸途徑限速酶HMG-CoA 還原酶活性影響GTPase 激活，GTPase激活受阻導致RANKL 的表達下降和NF-κB 激活受阻，從而抑制破骨細胞分化并誘導破骨細胞凋亡，發揮骨保護作用［20-21］。生育三烯酚尤其是γ-生育三烯酚作為已知的HMG-CoA 還原酶抑制劑，通過下調HMG-CoA 還原酶發揮其骨保護作用，而生育酚則沒有類似作用。最近一項體外研究發現［22］，γ-生育三烯酚呈劑量依賴方式刺激小鼠MC3T3-E1 細胞成骨分化，主要表現在MC3T3-E1 前成骨細胞中，γ-生育三烯酚顯著增強了堿性磷酸酶（ALP）的活性和骨形態發生蛋白-2（BMP-2）的基因表達，下調了HMGCoA 還原酶的表達，該結果提示生育三烯酚和其他甲羥戊酸抑制劑均具有維持骨骼健康的潛力。在卵巢切除小鼠模型中，口服γ-生育三烯酚（每天60 mg/kg）可有效防止卵巢切除引起的骨丟失，而補充甲羥戊酸可以逆轉生育三烯酚的這種骨保護作用，說明生育三烯酚促進骨骼健康可能是通過HMGCoA 還原酶依賴性機制實現的［23］。另一項研究發現，生育三烯酚促進MC3T3-E1 細胞礦化是通過下調HMGR 基因表達從而抑制甲羥戊酸途徑和增強MC3T3-E1 細胞中BMP-2 的表達起作用的［24］。此外，生育三烯酚與他汀類藥物聯合使用還會產生更大的骨骼獲益效應。研究發現生育三烯酚（60 mg/kg）與低劑量洛伐他汀（11 mg/kg）聯合使用可有效預防卵巢切除引起的骨質疏松癥［25］。與洛伐他汀相比，生育三烯酚在骨保護方面有更大的優勢，這可能是因為生育三烯酚促進骨重塑是通過多種途徑起作用的，而不只是通過甲羥戊酸通路單獨起作用的。

2.4 抑制破骨細胞分化 破骨細胞起源于骨髓單核/巨噬細胞系，RANKL 與破骨細胞前體細胞表面核因子-κB 受體活化因子（RANK）結合在誘導破骨細胞前體細胞向成熟破骨細胞分化過程中起關鍵作用。OPG 可由成骨細胞、骨細胞等分泌，OPG 是已知的RANKL 誘導受體，可阻止RANKL 與RANK 結合，調節破骨細胞增殖分化，抑制骨吸收。破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成的動態平衡使骨骼持續不斷地進行骨重塑，以滿足人體不同時期的功能需求。然而，長期破骨細胞的骨吸收增加超過成骨細胞的骨形成將會導致骨重塑失衡，引起病理性骨疾病如骨質疏松癥。生育三烯酚可通過抑制破骨細胞分化和活性防止骨質流失，促進骨骼健康。研究發現，γ-生育三烯酚呈濃度依賴性抑制破骨細胞形成；濃度為0.1 μmol/L 時，即可抑制RANKL 和M-CSF 誘導的人CD14+細胞來源的破骨細胞形成，具體表現在抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）陽性的多核細胞生成減少，而TRAP 是破骨細胞分化及骨吸收的特異性酶，是破骨細胞分化成熟的標志；濃度為1 μmol/L 時，完全抑制破骨細胞的吸收活性。研究證實，α-生育三烯酚也呈劑量依賴方式抑制小鼠骨髓來源的巨噬細胞分化的TRAP 陽性多核細胞的形成［26］。這與α-生育三烯酚可在破骨細胞形成的早期階段影響MAPK 活化而直接減少TRAP 陽性破骨細胞的生成，在后期通過抑制細胞外信號調節激酶和NF-κβ的活化來抑制c-Fos表達，進而抑制RANKL 介導的分化過程有關。在尼古丁誘導的骨質疏松大鼠模型中，給大鼠補充γ-生育三烯酚（60 mg/kg）后，大鼠體內的RANKL 表達受到抑制，而OPG mRNA 水平明顯增加，骨吸收被抑制［18］。在另一項睪丸切除的骨質疏松大鼠模型中，生育三烯酚（60 mg/kg）可顯著降低破骨細胞相關的RANKL基因表達［27］。

2.5 刺激成骨分化相關基因的表達 成骨細胞主要由間充質干細胞分化而來，骨形成過程涉及成骨前細胞增殖，成骨細胞分化和細胞外基質形成。間充質干細胞向各種譜系分化取決于各種轉錄因子的表達，例如Runt相關轉錄因子2（Runx2）對于間充質干細胞向成骨細胞分化非常重要，成骨相關轉錄因子抗體在成骨分化和骨形成中均具有重要作用，此外，還有ALP、I 型膠原（COL1）、β-catenin、BMP-2等［28］。生育三烯酚可促進成骨分化相關基因的表達增加成骨細胞數量、礦物質沉積和骨形成活性，并降低破骨細胞數量、骨侵蝕和骨吸收活性，從而改善骨質減少動物的骨密度和骨微結構退化。研究證實，生育三烯酚顯著增強MC3T3-E1 成骨細胞中成骨分化相關基因COL1、ALP、OCN、Osterix 等表達，促進了MC3T3-E1 細胞向成骨細胞分化［22］。在睪丸切除大鼠模型中，生育三烯酚增強了ALP、β-catenin、COL1 等骨形成相關基因的表達并逆轉了睪丸激素缺乏大鼠的骨質流失［27］。在卵巢切除大鼠模型中，生育三烯酚上調了BMP-2、OPG、Runx-2、Osterix 及血管內皮生長因子（VEGF）等基因的表達，下調了RANKL的表達，大鼠的骨骼結構和強度均有明顯改善［25］。

3 總結與展望

生育三烯酚在抗骨質疏松方面展現出多個靶點作用的潛力，可以通過抗氧化、清除氧自由基、激活Nrf2相關的抗氧化系統以及抗炎活性防止自由基和炎癥細胞因子對成骨細胞損傷，提高成骨細胞活性；通過抑制甲羥戊酸途徑使破骨細胞分化受阻并促進破骨細胞凋亡；通過抑制RANK-RANKL信號傳導通路從而抑制破骨細胞形成；通過增強成骨相關基因的表達促進成骨等多種途徑影響骨重塑過程。越來越多的動物實驗及臨床研究表明，生育三烯酚對骨骼產生的總體效應是有益的。而且，生育三烯酚的生物安全性良好，在防治骨質疏松的同時不會損傷正常細胞，這使得生育三烯酚的臨床應用前景更加受人關注。但是，生育三烯酚防治骨質疏松癥的作用還需要進一步的臨床研究驗證。