疲勞的動物模型及發生機制研究進展＊

王 智，閆明珠，夏天吉，劉新民，潘瑞樂，周云豐，陶 雪，常 琪

（中國醫學科學院/北京協和醫學院藥用植物研究所 北京100193）

疲勞廣泛存在于各類人群中，這與如今人們的生活方式以及緊張繁重的工作狀態密切相關。1982年召開的第五屆國際運動生化討論會上正式將疲勞定義為：“機體生理過程不能將其機能持續在特定水平上或器官不能維持其預定的運動強度”。目前臨床已經有一些常用的疲勞分類方式，按其發生性質，疲勞分為生理性疲勞和病理性疲勞。生理性疲勞通常是指機體由于體力或腦力勞動時間過久或強度過大造成體內組織器官所需營養物質和氧氣供應不足和乳酸等代謝物蓄積增多，進而向大腦發出信號而產生的疲勞感覺。生理性疲勞常表現為疲憊、乏力、身體酸痛和思想不集中等癥狀，可通過休息而恢復；病理性疲勞顧名思義是由于某種疾病而引發，如帕金森病、癌癥、多發性硬化癥和創傷性腦損傷等[1,2]，不可以通過休息而緩解。疲勞又可按其發生部位分成中樞性疲勞和外周性疲勞，中樞性疲勞是由于中樞神經系統功能的紊亂所引起，而外周性疲勞通常由中樞以外的原因所造成。因不同類型疲勞間的臨床表現較為混雜、分類界限不易明確，所以科研人員也開始逐漸意識到不可根據疲勞的劃分類型完全分割開來進行研究，不可單獨將疲勞視為中樞神經或外周系統所單獨產生的影響，其往往是信號相互作用的結果。

已有研究表明，嚴重的疲勞可擾亂人體的正常活動，機體在長期處于疲勞狀態下會引起睡眠障礙和學習記憶能力下降等癥狀，影響工作效率，對身心健康產生極大危害[3,4]。因疲勞發病原因廣且對機體傷害較為主觀，疲勞癥狀通常不為患者所重視。據統計，由于患癌癥而飽受疲勞影響的病人中，只有14%的人接受了疲勞相關的建議和治療[5]。現有緩解疲勞的藥物并不充足，更加穩定有效的抗疲勞藥物和保健品急需研制開發。近年來，疲勞問題逐漸為人們所關注，國內外眾多學者對疲勞進行了多方面的研究與報道，特別是隨著科技的進步和研究手段的提高，有關疲勞的分子機制研究也不斷深入。本文就近20年來在抗疲勞藥物和保健品研究中所涉及到的疲勞動物模型以及可能的發生機制進行了概況總結，為抗疲勞產品的功效評價和機制研究提供參考。

1 疲勞動物模型

構建有效且穩定的疲勞動物模型對于抗疲勞藥品和保健品的研發極其重要。理想的疲勞動物模型應盡可能模擬人類的疲勞體驗，并且能夠特異性的針對疲勞癥狀，從而可將其用于更明晰的機制研究。到目前為止，已報道的疲勞動物模型有以下種類，包括采用物理、化學、免疫和炎癥、放射線、手術、基因工程和癌因等單一因素或多種因素誘導的方法構建的一系列用于疲勞研究的動物模型。

1.1 物理法

物理法是指采用強迫運動、睡眠干擾或束縛等一系列物理方法導致動物疲勞。Sachdeva和Kumar等[6,7]使白化Laca小鼠每天進行強迫游泳或轉輪攀爬訓練6 min，連續15或21天可使其在轉棒上的運動時間縮短、強迫游泳中不動時間增長和自主轉輪運動降低等疲勞狀態。Tanaka等[8]將雄性SD大鼠在水深1.5 cm的籠中連續飼養5天，導致其由于睡眠不足而產生如負重游泳力竭時間縮短等疲勞樣行為。為模擬人們長時間在狹小環境中工作且得不到適度運動或活動的狀態，可對小鼠或大鼠進行長期束縛以誘導出疲勞動物模型。如Park等[9]將雄性C57BL/6J小鼠置于與其緊密接觸且無法活動的圓柱形束縛器（長10 cm，直徑3 cm）中，每天束縛3 h，共15天可造成小鼠在空場中自主活動降低和強迫游泳不動時間延長等疲勞癥狀。

為了模擬人們在日常環境中所受到的復雜因素影響，可同時使用上述物理方法進行多重刺激從而造成動物疲勞的模型。Zou等[10]采用雄性SD大鼠，每天于不同時間隨機進行電擊、冰水游泳和束縛刺激，共23天即可使大鼠出現轉輪運動降低、自主活動減少等疲勞現象。Shao等[11]每天采用束縛（置于圓柱形束縛器中4 h）、強迫運動（20 m/min跑步機上運動1 h）、擁擠環境飼養（10只大鼠在一個標準飼養籠中）和嘈雜聲中暴露（播放搖滾音樂12 h）4種方法對雌性SD大鼠進行刺激，通過空場檢測和懸尾檢測可發現，4周的多因素誘導可成功誘導疲勞模型。Zhao等[12]選用雄性昆明小鼠進行睡眠剝奪、強迫游泳、束縛和夾尾造成疲勞。其方法為前2周每天對小鼠進行12 h睡眠剝奪和2次50 min的游泳訓練，第3周時每天束縛4 h，第4周進行夾尾刺激最終造成負重游泳力竭時間縮短和空場自主活動降低等疲勞癥狀。

1.2 免疫和炎性法

免疫和炎性法是通過注射給予動物可誘發免疫反應或炎性反應的物質而造成動物疲勞的方法，這些物質包括免疫誘導劑、活菌、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等。Katafuchi等[13]以3 mg·kg-1劑量對雄性Wistar大鼠腹腔注射聚肌胞苷酸（Polyinosinic-polycytidylic acid，poly I:C），在注射后的第9天大鼠自主轉輪活動下降至正常水平的40-60%。He等[14]給雌性BALB/c小鼠每2周腹腔注射0.2 mL滅活布魯氏菌（共6次）后，其自主轉輪活動量大幅下降。Zhang等[15]給予雌性C57BL/6小鼠和雌性C57BL/6 NLRP3 KO小鼠腹腔注射3 mg/kg LPS（Escherichia coli 0111:B4），通過誘導其全身炎性反應而造成其自主活動降低且轉棒測試運動能力下降等疲勞癥狀，并且發現NLRP3/caspase-1通路參與LPS誘導的疲勞行為的機制。Bonsall等[16]于小鼠側腦室分別注射2、10或50 ng三種劑量的重組小鼠IL-1β誘導其疲勞，可使它們自主轉輪運動和自主活動降低。

1.3 基因工程法

所謂基因工程法是指采用基因導入、誘導突變或敲除等技術造成動物體內細胞中基因發生變化而造成的動物疲勞模型。相對于其他模型，該方法可以研究特定基因對于疲勞的調控情況且具有可遺傳性。De Groot等[17]通過使用N-乙基-N-亞硝基脲（ENU）誘變C57BL/6J小鼠，使其Slc2a4基因（編碼胰島素反應性葡萄糖轉運蛋白GLUT4基因）中位于第10外顯子的一個遠端單核苷酸（A到T）發生突變，導致此小鼠體重降低，自主轉輪運動降低，表現出明顯的疲勞狀態。Golumbe等[18]構建了RAG2基因敲除小鼠，使小鼠的免疫力顯著降低,通過自主轉輪、前肢握力等試驗證明了其免疫低下可引起疲勞。該模型在一定程度上模擬了臨床人體免疫系統受到抑制或缺失時的疲勞狀態。

1.4 化學法

化學療法是惡性腫瘤的重要治療手段之一，但在抑制及殺滅腫瘤細胞的同時也會對機體造成不良影響，如食欲下降、惡心嘔吐、白細胞和紅細胞減少、免疫低下等，因此機體會產生嚴重的疲勞感覺。化學法造模即通過給予動物化療藥物來模擬化療過程中所致的疲勞狀態。Ray等[19]連續5天對雌性BALB/cJ小鼠眶靜脈竇注射10 mg·kg-1紫杉醇造成小鼠轉輪和空場中的自主活動量降低、懸掛時間減短等疲勞樣行為。Dougherty等[20]選用雌性C57BL/6NCr小鼠每天腹腔注射一次5-氟尿嘧啶（60 mg·kg-1），連續5天造成其空場中自主活動量減少和跑臺運動能力降低等疲勞表現。

1.5 放射法

同化療法一樣，放射線療法也是臨床用于治療惡性腫瘤的重要方法之一，它在殺傷癌細胞的同時，對正常組織細胞也產生損傷，因此引發機體疲勞。為模擬放療病人的疲勞情況，可通過放射法造成小鼠的疲勞模型。Wolff等[21]使用GammaCell 40輻射器對麻醉狀態下的雄性C57BL/6小鼠進行每天8 Gy、連續3天的下腹部輻射，導致小鼠疲勞，表現出自主活動量降低等疲勞樣行為。McDonald等[22]使雄性C57BL/6小鼠接受每次2.84 Gy、每周5次、共24次，累計68.2 Gy的盆骨外照射放療，使其自主轉輪運動減少，模擬了前列腺癌在外周放射治療下所致的疲勞狀態。

1.6 癌因性

癌癥患者由于其貧血、內分泌失調、新陳代謝異常、以及炎性反應等影響而常常會感覺到疲勞且在癌癥漫長的治療過程中，仍然會長時間存在身體和精神上的疲勞現象[23]。為了模擬癌癥患者產生的癌因性疲勞，可通過移植癌細胞構建癌癥動物從而造成疲勞動物模型。Norden等[24]通過在雌性CD2F1小鼠肩胛骨之間皮下接種colon26細胞建立了模擬腫瘤患者的疲勞模型。接種后小鼠肌肉質量降低，且自主轉輪活動下降，3周時握力下降。Bohlen等[25]在雌性C57BL/6小鼠左側靠近第4乳頭的乳腺脂肪墊中植入E0771細胞以模擬乳腺癌患者疲勞，結果顯示第4周時出現顯著的肌肉疲勞現象。

1.7 卵巢摘除法

女性隨著更年期的到來，體內激素水平發生改變從而產生肥胖和肌肉丟失等情況。Lin等[26]選用雌性ICR小鼠進行卵巢摘除手術，造成小鼠負重游泳力竭時間縮短及抓力減小等疲勞表現。卵巢摘除法以造成由于激素水平改變而引起的雌性小鼠體力疲勞狀態，用于抗疲勞功效評價的模型。

由于疲勞是一種主觀感受，所以在有關疲勞的動物研究中很難對其進行準確的描述和測量，這給研究造成了一定阻礙。各種原因所導致的疲勞均在體力疲勞上有所體現，表現在體力降低和疲乏等，故目前對疲勞的評價都是以體力疲勞的行為學檢測為依據。迄今為止，常用的體力疲勞行為學檢測方法有強迫運動和自主運動兩大類。強迫運動方法中包括負重強迫游泳檢測、前肢握力檢測、攀爬檢測、轉棒檢測、跑臺檢測、轉輪檢測、懸掛檢測和懸尾檢測等，這類方法通常是通過衡量動物在被迫運動達到極限時所做的運動時長、運動量或肌肉力量，從而對其體力的疲勞狀況進行判斷。通過自主活動評價疲勞發生情況則是在不給動物任何干預的情況下，通過評價其在空場中的自主活動量或自發進入轉輪中的運動量來反應其疲勞程度的，此檢測方法的原理與臨床疲勞患者的主動運動量減少相似。

2 疲勞的發生機制

目前人們對疲勞發生的機制提出了一系列學說，包括能量耗竭學說、代謝產物堆積學說、內環境穩態失調學說、自由基影響理論和中樞神經系統保護性抑制學說。在抗疲勞研究中，學者基于以上機制對相關生化指標進行檢測從而對疲勞的發生及其內在原因進行判斷。

2.1 能量耗竭學說

研究表明機體主要能源物質如高能磷酸物、血糖（glucose，Glu）和糖原等被大量代謝消耗是疲勞發生的主要原因。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）中的高能磷酸鍵水解可快速釋放能量，運動時需要消耗大量ATP，Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶是ATP水解過程中的主要酶，疲勞狀態下線粒體受損，其活性較低[27]。糖是運動的主要能量來源，機體通過糖的有氧氧化和無氧氧化產生能量生成ATP，機體疲勞往往伴隨著糖類能源物質耗竭產生。當機體運動時Glu先被代謝進行供能，隨運動量增加機體進一步大量消耗肝糖原和肌糖原。因此，對抗肝糖原和肌糖原的補充常常被用來評價抗疲勞保健品的功效。血清中脂肪代謝的標志物為非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acid，NEFA）和甘油三酯（triglyceride，TG），它們也可作為疲勞生化檢測的重要指標[28,29]。NEFA含量增加，TG含量減少表明運動期間脂肪代謝增加，糖原消耗率降低，抗疲勞運動表現加強。肝臟和肌肉組織中與能量代謝相關的酶，如丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）和蘋果酸脫氫酶的（malate dehydrogenase，MDH）活性可以進一步反應疲勞的狀態[30]。線粒體活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK）及其相關通路具有協調代謝和能量的重要作用，與機體疲勞的發生密切相關。激活AMPK不僅可以促進Glu攝取和增加糖原利用等，還可通過激活下游過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1（peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α）促進肌肉內線粒體氧化代謝和生物合成，從而促進肌纖維類型轉化，紅肌比例增大，表現出抗疲勞作用[31-32]。

2.2 代謝產物堆積學說

代謝產物堆積學說認為在大量運動之后機體內乳酸、氨等代謝產物大量積累從而造成疲勞的產生。在劇烈運動時肌肉內糖的無氧氧化增加，產生的乳酸大量堆積會降低肌肉組織和血液中pH值，抑制肌肉收縮從而造成疲勞。血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）是氨基酸、蛋白質代謝的產物，在劇烈運動時機體會進一步消耗蛋白質進行供能，血清中尿素氮的增加，引起機體疲勞。運動后當血清尿素氮相比含量較低時，說明蛋白質分解減少，運動耐受能力增加[33]。其血氨（blood ammonia，BA）降低也可以有效保護中樞神經從而減輕疲勞[28]。

2.3 內環境穩態失調

正常生理狀態下，機體的內環境各組分如K、Na、Ca、Mg等離子處于穩定的動態平衡狀態。當劇烈運動后這些成分的濃度會發生紊亂，造成內環境平衡失調從而引起疲勞。劇烈的肌肉收縮引起細胞K+外排、Na+和Cl－內流，細胞外和細胞內K+和Na+濃度明顯變化。Na+-K+-ATP酶活性增加可以穩定Na+和K+的濃度梯度和細胞膜興奮性，在劇烈運動時，一部分Na+-K+-ATP酶失活，離子濃度紊亂產生疲勞[34]。Ca2+在肌肉收縮過程中發揮重要作用，劇烈運動會使Ca2+從肌漿內質網泄漏，肌肉收縮力變小，松弛時間明顯延長，從而使得疲勞加重[35]。Mg2＋是許多細胞過程中必不可少的因子，研究發現慢性疲勞綜合征患者的靜息游離Mg2＋水平更高[36]。ATP是Mg2＋重要的結合位點，ATP的大量分解可能是疲勞時Mg2＋增加的一個來源[37]。

2.4 自由基影響理論

自由基是機體新陳代謝過程中產生的具有未成對電子的物質。由于其化學性質非常活躍，可與多不飽和脂肪酸、蛋白質和核酸等發生爭奪電子的作用。機體在大量運動后，體內氧化代謝增強，骨骼肌、心臟、肝臟等組織內產生大量的自由基，無法快速清除的自由基可導致脂質、蛋白質和核酸等氧化損傷[38]。當脂質過氧化反應加強，可破壞細胞膜及多種細胞器使細胞正常的代謝功能受損，產生機體疲勞；并且大量運動產生的活性氧自由基還會誘導蛋白質氧化從而導致肌肉疲勞[39]。

在抗疲勞產品的活性評價和機制研究中，可以通過機體的抗氧化能力來反應其抗疲勞水平。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）是體內主要的抗氧化酶，通過測定機體內這些酶的活性可以間接反應被測物的抗疲勞效果[40]。還可以通過測定血清以及肌肉組織的總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）來了解自由基對組織的損傷程度[41]。氧化應激會造成細胞膜的完整性受損從而誘發細胞損傷，因此也可以通過檢測細胞氧化損傷后的標志物進行疲勞程度的評價。丙二醛（malondialdehyde，MDA）為細胞膜脂質過氧化產物，其在體內的水平通常被作為判斷疲勞狀態的指標。血清中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和 乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH）是肌肉損傷的標志物，當血清中其含量減少時表明藥物對肌肉細胞起保護作用[28,42]。心肌細胞和肝細胞被氧化損傷時谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和 丙 氨 酸 轉 氨 酶（alanine aminotransferase，ALT)會滲漏到血清中，可通過對血清中其水平的監測進行疲勞情況分析[43]。核因子E2相 關 因 子2（nuclear factor erythroid-2-related actor 2，Nrf2）是調節細胞抗氧化反應的關鍵分子，并調節下游血紅加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）、硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）和B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma，Bcl2）等信號，其在肝臟和肌肉組織中表達增強也提示抗疲勞能力的提高[30,44]。并且疲勞發生過程中的氧化應激還可引起炎癥反應，從而使腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和 白 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等多種炎性細胞因子發生改變[41,45]。

2.5 中樞神經系統的保護性抑制學說

中樞神經系統對機體的運動具有自我保護作用。機體在過度運動中大量神經沖動會傳導到大腦皮層，引起神經長時間興奮，多種神經遞質如5-羥色胺、多巴胺積累或消耗，神經細胞消耗過多[46]。為避免機體的這種大量消耗而導致的損傷，大腦皮層進行保護性抑制調節從而產生機體疲勞。

3 小結和展望

引起疲勞的原因眾多，不同的誘因所產生的疲勞感受也不盡相同。通過強迫運動或應激等物理造模方法可模擬因短時劇烈運動或長期過度運動、或因緊張的生活工作壓力而導致的生理性疲勞；而通過免疫或炎性反應、移植癌細胞造成癌癥、放化療和卵巢摘除手術等手段造成的動物慢性疲勞模型亦可很好地模擬因疾病引發的病理性疲勞；此外，還可通過疊加上述多種誘因來造成復合因素所致的疲勞。當今人們的生活習慣和工作性質較以往發生了很大改變，因此疲勞的表現也有很大不同，除了體力上的疲勞外，還常常伴有精神上的疲勞，比如精神不集中、興趣低落等。因此，在進行抗疲勞藥物和保健品研究過程中應針對疲勞發生的原因和類型選擇更加貼合的疲勞動物模型，從而更有效地評價其功效，開發出更加符合該疲勞發生機制的產品。并且，在抗疲勞藥物和保健品的研發中，科研人員應關注到中藥可能具有的更大優勢。相比化學藥，中藥可以從多器官、多層次發揮功能，且在可能長期服用的過程具有相對更小的毒副作用和成癮性。

此外，目前雖有上述一些被廣泛認可的疲勞發生機制學說，但其潛在的病理生理機制尚并不明晰。現在，許多學者都對疲勞背后的骨骼肌功能和神經生物學產生了濃厚興趣，揭示了其可能與肌纖維類型、中樞神經系統的調控和晝夜節律等相關。在疲勞發生的機制研究中還應當將中樞與外周結合起來，多角度和多水平進行研究，探究其內在的調控網絡。關于不同起因產生的疲勞還有待于科學工作者進行深入細致的研究，希望能在其中找到共同的神經生物學基礎為臨床疲勞的治療提供有力支撐。