蛋白酶K預處理在SARS-CoV-2核酸提取中的應用探討*

王 念，巫麗娟，周 易，宋興勃，葉遠馨，鐘慧鈺，周汶靜，陶昕彤，劉堂喻亨，宋佳佳，斯艷君，陸小軍，應斌武

四川大學華西醫院實驗醫學科，四川成都 610041

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的迅速傳播，已嚴重危害人類健康。早期實驗室診斷可及時隔離新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者及其密切接觸者，打破傳播鏈[1-2]。同時，早期診斷和治療可使患者有更好的結局[3]。大多數臨床實驗室采用實時熒光定量PCR(qPCR)對SARS-CoV-2進行核酸檢測[4]。然而，SARS-CoV-2核酸檢測的陽性率并不高。其中，核酸提取效率是影響其檢出率的重要因素之一。因為蛋白酶K(PK)可對生物標本中的蛋白質進行消化，同時還可降解標本中的RNA核酸酶，阻止RNA被降解，對標本進行PK預處理可能會提高核酸的提取效率，從而降低其循環閾值(Ct值)，提高陽性檢出率。因此，本文就核酸提取前預處理是否需要加入PK進行探討。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取本院2020年1月25日至6月30日臨床上收集的COVID-19患者(根據SARS-CoV-2相關指南確診)[4]的核酸陽性標本共70份，其中包括50份鼻咽拭子標本和20份糞便標本。

1.2儀器與試劑 鼻咽拭子含植絨拭子及3 mL保存液購自深圳海爾施生物醫藥股份有限公司；病毒RNA提取采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(購自法國生物梅里埃公司)；PK試劑購自瑞士羅氏公司；SARS-CoV-2檢測試劑購自湖南圣湘生物科技股份有限公司，采用SLAN-96P儀(購自上海宏石醫療科技有限公司)進行qPCR擴增。

1.3標本處理與提取 所有標本先經過56 ℃、30 min 滅活。 鼻咽拭子標本：取出標本后混勻保存液，分別取2份1 mL待測標本于1.5 mL小型離心管中，其中1份加入50 μL PK(20 mg/mL)，56 ℃下孵育30 min，另1份則直接在56 ℃下孵育30 min。糞便標本：取黃豆般大小的大便置于15 mL離心管中，加入3 mL生理鹽水充分振蕩混勻，1 000 r/min離心 5 min，分別取2份1 mL上清液于1.5 mL 小型離心管中，其中1份加入50 μL PK(20 mg/mL)，56 ℃下孵育30 min，另1份則直接在56 ℃下孵育30 min。所有標本的SARS-CoV-2核酸提取均采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統進行裂解、吸附和洗脫，洗脫體積為50 μL。

1.4標本擴增 根據試劑盒說明書對qPCR擴增體系進行配制，于qPCR儀上進行SARS-CoV-2的ORF基因和N基因擴增檢測。擴增循環參數設定：反轉錄50 ℃ 30 min；cDNA預變性95 ℃ 1 min ；變性 95 ℃ 15 s；退火、延伸及熒光采集60 ℃ 30 s，45個循環。

1.5結果判讀 首先，分析內標VIC通道是否有擴增曲線，且擴增產物的熒光信號是否達到設定的熒光閾值所對應的Ct≤40。然后，再分析FAM或ROX通道是否檢測到典型的S型擴增曲線。若Ct≤40，則判定該結果為SARS-CoV-2核酸檢測陽性；若FAM及ROX通道均未檢測到典型的S型擴增曲線(未檢測到Ct)，或Ct>40，則表示SARS-CoV-2核酸檢測陰性。

2 結 果

2.1鼻咽拭子標本預處理的結果比較 在確診SARS-CoV-2患者核酸陽性的50份鼻咽拭子標本中，結果顯示，未處理組的ORF基因的Ct值為33.92±4.42，PK組的ORF基因的Ct值為34.21±3.99，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；未處理組的N基因的Ct值為30.83±3.99，PK組的N基因的Ct值為31.12±4.31，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統提取SARS-CoV-2核酸時，增加PK預處理步驟對鼻咽拭子標本的檢測結果沒有影響。見圖1。

2.2糞便標本預處理的結果比較 在確診SARS-CoV-2患者核酸陽性的20份糞便標本中，結果顯示，未處理組的ORF基因的Ct值為31.37±5.90，PK組的ORF基因的Ct值為31.08±5.71，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；未處理組的N基因的Ct值為27.74±3.47，PK組的N基因的Ct值為27.80±3.29，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統提取SARS-CoV-2核酸時，增加PK預處理步驟對糞便標本的檢測結果沒有影響。見圖2。

注：A為鼻咽拭子SARS-CoV-2標本ORF基因Ct值分散情況；B為鼻咽拭子SARS-CoV-2標本N基因Ct值分散情況；C為同一鼻咽拭子標本經兩組平行實驗后PCR擴增曲線圖。

注：A為糞便SARS-CoV-2標本 ORF基因Ct值分散情況；B為糞便SARS-CoV-2標本N基因Ct值分散情況；C為同一糞便標本經兩組平行實驗后PCR擴增曲線圖。

3 討 論

SARS-CoV-2侵入人體宿主細胞是由細胞膜上血管緊張素轉化酶2受體所介導，血管緊張素轉化酶2受體廣泛存在于呼吸道、口腔、回結腸等部位的上皮細胞中。呼吸道標本、消化道標本、血液標本均可作為實驗室核酸檢測的標本來源。由于COVID-19患者上呼吸道癥狀較弱，理論上下呼吸道標本(深部咳痰和氣道抽取物)應作為核酸檢測首選，但因多數患者咳痰困難，下呼吸道標本不易獲得且存在較大的生物安全操作風險，故臨床病原體標本主要以較易獲得的鼻拭子或口咽拭子標本為主。因SARS-CoV-2可在人腸道上皮細胞進行感染復制，且有研究提出糞便中SARS-CoV-2核酸檢出持續時間更長[5]。因此，糞便標本中病毒核酸檢出率對于患者是否達到出院標準及是否存在傳染性的判斷具有重要意義。目前糞便也是主要的檢測標本之一。因qPCR具有快速、簡便、特異度高、靈敏度高、成本較低的特點，已成為SARS-CoV-2核酸檢測的主要檢測技術。目前，國內有上百家企業研發了SARS-CoV-2 qPCR檢測試劑盒，其中有9個已經獲得了國家藥品監督管理局批準。在符合國家藥品監督管理局批準程序的臨床試驗中，所有試劑盒與確診病例標本的靈敏度均超過90%。然而，在實際的臨床檢測中，患者的陽性檢出率并不高，陽性檢出率僅為30%～50%[6-8]。影響核酸陽性檢出率的因素較多，其中核酸提取效率是主要因素之一。

雖然，影響核酸提取效率的因素較多，但可以從多方面進行改進，從而提高核酸陽性檢出率。標本提取前預處理是臨床上提高核酸提取效率的常用方法，其中，利用PK進行預處理最為常見。而關于PK預處理是否可以提高核酸提取效率，國內外所做研究報道較多，但結論并不一致。如在KHELAIFIA等[9]對糞便標本中細菌DNA的提取一文中指出PK的預處理可提高DNA獲得率，JIKUZONO等[10]指出PK預處理可提高用液基細胞溶液固定的甲狀腺細胞的RNA回收率，但GOLDSCHMIDT等[11]則在對感染性病原體DNA提取的預處理一文中提出，在某些病原體的提取中，PK的預處理沒有必要。而造成這些結論不一的原因可能有如下幾點：(1)可能是PK性能存在一定差異；(2)可能是寄生蟲、細菌、病毒等不同病原體(尤其是RNA病毒)對PK的預處理效果存在差異；(3)不同的標本類型及提取方法可能影響PK的預處理效果等。

在本研究的兩組平行實驗中，經PK預處理的50份含有細胞保存液的鼻咽拭子標本的核酸檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)，且在此次研究的20份糞便標本中，其結果與鼻咽拭子標本一致，PK的預處理在兩組平行實驗中差異無統計學意義(P>0.05)。JEDDI等[12]關于利用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統對寄生蟲病和真菌病DNA提取優化的分子診斷研究中，提出利用NucliSENS easyMAG系統進行核酸提取時，由于NucliSENS easyMAG磁珠提取系統中裂解緩沖液具有高解離活性，使PK消化在大多數情況下是可有可無的，與本研究結果相符。但有研究表明在對甲型流感病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒的痰液標本進行預處理的研究中，其研究結果均顯示PK的預處理較其他預處理方法有較高的提取效率[13-14]。而導致這種結果差異的主要原因可能跟實驗標本的類型不同有關。由于痰液標本中黏液絲的影響，標本可能不易裂解釋放病原體，在操作過程中易導致取樣不均，以及在進行磁珠提取時易堵塞槍頭而無法進行自動提取進而造成結果的不準確。因此，在痰液標本中加入PK進行預處理尤為重要，可以提高RNA的提取效率。而在本研究中，大多數標本為含有保存液的鼻咽拭子標本，由于細胞保存液中緩沖劑的存在，能最大限度地保持細胞的完整性，并使之充分懸浮及分散，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統提取病原體時很容易釋放核酸。因此，對鼻咽拭子標本進行PK預處理可能并不能提高其提取效率。而對于糞便標本，因本研究中糞便標本僅20份，其PK預處理的結論仍需大量標本進行驗證。

目前對SARS-CoV-2檢測方法的相關研究較少，其中僅有一篇文獻[15]提到了PK預處理在“一步法”中的研究。而在實際情況下，因“一步法”檢測陽性率較低，其僅用于提取試劑缺乏或一些緊急檢測，在常規的SARS-CoV-2臨床標本檢測和篩查中，該方法已被禁止采用。而本研究則討論PK預處理后，采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統對核酸提取效率的影響，具有一定的創新性。

本研究存在一定局限。首先，樣本量有限，仍需擴大樣本量進一步驗證結論。本研究評估了鼻咽拭子標本和糞便標本，未對具有較高檢出率的痰液標本進行研究，主要由于COVID-19患者上呼吸道癥狀較弱，痰液標本不易獲得，且由于痰液標本中黏液絲的影響，可能導致研究過程中取樣不均，從而影響研究結果的準確性。同時，PK預處理在不同提取方法中的影響也應考慮。

綜上所述，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統對含有細胞保存液的SARS-CoV-2鼻咽拭子標本和糞便標本進行核酸提取時，對加PK和不加PK預處理的兩組平行實驗進行比較，PK的預處理對SARS-CoV-2的檢測結果沒有影響。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統對SARS-CoV-2標本進行提取時，由于裂解緩沖液的高解離活性，可無需進行PK預處理，在一定程度上節省了時間和耗材。