心臟疾病標志物cTnT和H-FABP聯合檢測微流體測試卡的開發及評價*

孫雪梅，許 強，孫曉萌，王軼鵬，呂衍民，孫曉艷，孟凡達

山東省醫學科學院基礎醫學研究所/山東第一醫科大學，山東濟南 250062

心臟疾病發病時急且危重，嚴重時會危及到患者的生命，心臟疾病生物學標志物應用于心臟疾病患者的早期檢測能夠幫助臨床醫生快速而準確地診斷，從而做出進一步的治療決策，挽救患者的生命[1-7]。在心臟疾病發展的不同階段患者血清中存在相應的標志物，直接或間接反映疾病狀況。心肌肌鈣蛋白(cTn)被視為心臟疾病診斷的“金標準”，廣泛用于心臟疾病的診斷中[8-9]，cTn具有T、I、C 3種亞型，其中cTnT和cTnI是心肌特異性蛋白，但是，在心臟疾病患者胸痛發作后4～6 h內其反應敏感性相對較差。心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)在發生心肌缺血或損傷時能夠迅速穿透細胞膜釋放到血液中，早期診斷靈敏度高[10]。臨床上，進行cTn與H-FABP的聯合檢測能夠結合2種標志物的優勢，極大提高診斷的靈敏度和特異度。

即時檢測(POCT)能夠實現床旁診斷，在采樣現場即刻進行分析，快速得到檢測結果。微流體技術與POCT檢測方法相結合在心臟疾病的臨床診斷上已經得到了廣泛的應用[11-15]。POCT應用于心臟疾病標志物的快速檢測可輔助醫生對患者采取及時的治療措施，對個性化治療的發展、醫療水平的提高、醫療費用的減控有重要意義。因此，建立一種低成本的，能夠同時進行多種靶標快速檢測的，靈敏度較高的心臟疾病標志物檢測方法意義重大。

本研究建立了一種在自驅動微流體測試卡上快速聯合檢測心臟疾病標志物cTnT和H-FABP的方法。本研究建立的檢測方法有特異性良好、檢測時間短、檢測結果準確等優點，實現了心臟疾病標志物的聯合檢測，能夠滿足臨床需求，有良好的應用前景。現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 激光切割機購自美國Universal公司；Nano-Plotter超微量點樣儀購自德國GeSim公司；鼓風干燥箱購自上海精宏實驗設備有限公司；冷凍離心機購自德國Sigma公司；多模式微孔板分析儀購自德國PerkinElmer公司；高聚合度有機玻璃板PMMA(1 mm)購自深圳鴻年金屬材料有限公司；3M雙面膠(100 μm)購自深圳凱誠興科技有限公司。H-FABP抗原標準品、捕獲抗體F2和標記抗體F1(2種不同的抗H-FABP單克隆抗體)、cTnT抗原標準品、捕獲抗體T2和標記抗體T1(2種不同的抗cTnT單克隆抗體)均購自芬蘭Hytest公司；羧基修飾Eu時間分辨熒光微球(200 nm)購自上海微測生物科技有限公司；吐溫-20、硼酸、硼砂、氯化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺(EDC)、戊二醛、小牛血清均購自北京欣經科生物科技有限公司；聚苯乙烯接枝馬來酸酐、甲苯購自北京藍弋化工產品有限責任公司；海藻糖購自日本林原公司；其他未提及試劑均為分析純；實驗用水均為超純水。

1.2緩沖溶液、稀釋液等溶液的配制 (1)碳酸鹽緩沖液的配制：稱取無水碳酸鈉1.59 g，碳酸氫鈉2.93 g，用超純水溶解至900 mL，使用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值為9.60后，定容至1 000 mL。(2)捕獲抗體點樣緩沖液的配制：稱取海藻糖1 g，使用pH值為9.60的碳酸鹽緩沖液溶解至10 mL。(3)2-N-嗎啉代-乙基磺酸(MES)緩沖液的配制：稱取MES 10.6 g，用超純水溶解至450 mL，使用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值為5.80后，定容至500 mL。(4)硼酸緩沖液的配制：稱取硼酸4.02 g，硼砂3.34 g，氯化鈉0.95 g，用超純水溶解至450 mL，用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值為8.20后，定容至500 mL。(5)標記抗體微球稀釋液的配制：稱取蔗糖2 g，牛血清清蛋白0.20 g，吐溫-20 100 μL，使用pH值為8.20硼酸緩沖液溶解至10 mL。

1.3時間分辨微球的標記 取50 μL熒光微球，使用pH值為5.80的MES緩沖溶液清洗，11 000 r/min離心5 min去除上清液，將微球使用500 μL MES緩沖液超聲重懸；加入10 μL EDC(50 mg/mL)溶液，室溫反應20 min；11 000 r/min離心5 min去除上清液，使用pH值為8.20的硼酸緩沖液超聲重懸微球至500 μL；加入50 μg標記抗體，室溫振蕩反應2 h；加入50 μL含10% 牛血清清蛋白的硼酸緩沖液，封閉反應1 h；11 000 r/min離心5 min去除上清液，使用1 mL標記抗體微球稀釋液超聲重懸微球，4 ℃儲存。

1.4測試卡的設計及組裝 使用激光切割機分別將PMMA切割成上蓋和底板，將3M雙面膠切割成通道結構。上蓋使用等離子表面活化后，使用pH值為2.00硫酸溶液浸泡處理后，烘干備用；底板使用等離子表面活化后，APTES溶液浸泡10 min，N2吹干后浸泡于戊二醛溶液中10 min，N2吹干后分別在指定區域固定捕獲抗體及標記微球，按步驟組裝成微流體測試卡。

1.5免疫反應流程 檢測時，直接向加樣區滴加80 μL血清，固定在通道中的標記微球首先與標本中待測抗原反應形成抗原-標記微球復合物；在標本流經捕獲抗體固定區時，抗原-標記抗體復合物與固定在檢測區的捕獲抗體反應，形成捕獲抗體-抗原-標記微球復合物；檢測區微球的捕獲量與標本中抗原濃度相關。在激發波長340 nm、發射波長615 nm、延遲時間600 μs條件下使用多模式微孔板分析儀測定檢測區熒光強度，從而實現對標本中待測抗原的定量。整個檢測過程能夠在10 min以內完成。見圖1。

1.6統計學處理 構建標準曲線時，每個標準點測量3次，建立與標準濃度之間的參考曲線，使用origin進行線性擬合并計算相關系數。進行方法學比較時，每個實際血清樣本測試1次，并將測試結果與商業化平臺測試結果進行比對，使用origin進行線性關系對照，并計算兩者之間的線性相關系數。

2 結 果

2.1捕獲抗體點樣濃度優化 分別使用不同濃度的捕獲抗體進行點樣，測定不同cTnT和H-FABP濃度的標本，考察捕獲抗體點樣濃度對免疫反應的影響。對于2種抗原的檢測，當捕獲抗體的點樣濃度達到50 μg/mL時，檢測的熒光信號值均不再隨點樣抗體濃度的增加而增加。在測試卡制作時，針對2種標記物的檢測捕獲抗體點樣濃度均確立為50 μg/mL。見圖2。

圖1 免疫分析反應流程圖

注：A為不同捕獲抗體濃度檢測cTnT；B為不同捕獲抗體濃度檢測H-FABP。

2.2標記抗體使用量優化 分別使用不同體積標記微球固定在通道內，測定不同cTnT和H-FABP濃度的標本，考察標記抗體使用量對免疫反應的影響。當標記微球使用量達到1 μL時，檢測的熒光信號值達到飽和值。在后續實驗中，針對2種標志物檢測標記微球使用量均選擇1 μL。見圖3。

2.3標準曲線 在設定好的檢測條件下，建立cTnT在0.1～100.0 ng/mL范圍的標準工作曲線(n=3)，標準曲線的相關系數>0.99，檢出限為0.02 ng/mL(s/n=3)；建立H-FABP在0.5～100.0 ng/mL范圍的標準工作曲線(n=3)，標準曲線的相關系數>0.99,檢出限為0.05 ng/mL(s/n=3)。針對2個指標檢測的線性關系均良好，可以滿足臨床標本的定量檢測的需求。

2.4穩定性 考察了組裝好的測試卡在37 ℃放置一定時間后的檢測性能，其中cTnT和H-FABP的濃度均為10 ng/mL。在37 ℃放置7 d后，測試卡對2種標志物的檢測均能保持良好的檢測性能，說明測試卡的穩定性良好。見圖4。

注：A為不同標記抗體量檢測cTnT；B為不同標記抗體量檢測H-FABP。

2.5特異性 考察了cTnT和H-FABP的濃度均為10 ng/mL時，在待測標本中分別加入1、10 μg/mL的C-反應蛋白、50 ng/mL的降鈣素原，測試不同濃度、不同類別干擾物對檢測結果的影響，結果顯示干擾物的加入對2種抗原的檢測沒有影響，說明該測試卡對2種標志物的檢測特異性良好。見圖4。

注：A為測試卡穩定性；B為測試卡特異性。

2.6血清測試方法學比較 利用建立起的微流體熒光免疫測試卡，檢測了31份cTnT的臨床血清標本，將這些標本的檢測結果與羅氏公司的cobas?e411電化學發光全自動免疫分析儀的測試結果進行比較。R2=0.981 4，說明兩者測試結果一致，系統之間相關性良好；利用建立起的微流體熒光免疫測試卡，檢測了33份H-FABP的臨床血清標本，將這些標本的檢測結果與酶標試劑盒的測試結果進行比較。R2=0.957 5，說明兩者測試結果一致，系統之間相關性良好。

2.7聯合檢測性能評估 使用添加法配制cTnT和H-FABP的混合血樣，利用測試卡進行了人血清中2種靶標的聯合檢測。測試卡對2種標志物進行聯合檢測時，平均回收率>90%，批內精密度<15%，說明該方法有良好的檢測效果，能夠滿足臨床上的檢測需求。見表1。

表1 2種標志物聯合檢測性能評估(n=4)

3 討 論

臨床上，幾種生物學標志物的聯合檢測能夠極大地提高診斷的穩定性及特異性，多靶標同時檢測可減少標本的使用量，減輕患者的痛苦；傳統的免疫比濁法、酶聯免疫吸附測定、免疫側向的方法難以滿足多靶標同時檢測的要求。微流體技術與免疫測定技術相結合，使用時間分辨熒光的方式進行標記，能夠綜合幾種方法的優勢，極大地降低熒光檢測中背景熒光的干擾，提高檢測的穩定性和特異性。

本研究建立了一種能夠實現心臟疾病標志物cTnT和H-FABP聯合檢測的微流體測試卡，為了使測試卡的性能達到最佳，本研究分別對捕獲抗體點樣濃度和標記抗體使用量進行了優化，結果表明，捕獲抗體點樣濃度達到50 μg/mL時，免疫反應達到飽和；標記微球使用量1 μL時，免疫反應達到飽和；加急反應顯示測試卡在37 ℃放置7 d仍能保持較高的反應性。在設定好的反應條件下，該測試卡在10 min內即可實現2種心臟疾病標志物的聯合檢測，cTnT在0.1～100.0 ng/mL范圍內有良好的線性關系，檢出限為0.02 ng/mL；H-FABP在0.5～100.0 ng/mL范圍內有良好的線性關系，檢出限為0.05 ng/mL。針對于2種標志物的檢測，該方法回收率為94.0%～109.5%，批內精密度均<15%，呈現出良好的精密度和重現性。同時，進行血清檢測時，與商業化的檢測方法比較，相關系數均>0.95，測試結果一致，相關性良好。

該測試卡可以應用于腫瘤、過敏原等其他標志物的檢測，與電化學等傳感器平臺集成，能夠實現更廣泛的應用，從而更適用于臨床的快速檢測。

綜上所述，本研究建立了微流體測試卡對心臟疾病標記物cTnT和H-FABP的聯合檢測方法，與臨床上使用的商業化儀器和方法比較一致性良好；使用添加法進行了cTnT和H-FABP的聯合檢測，回收率、精密度均能滿足臨床要求，說明該檢測方法能夠應用于心臟疾病標志物的檢測。同時，該檢測方法檢測成本低、制作方法簡單、操作簡便、能夠在10 min內完成相關標志物的檢測，檢測特異性和檢測范圍均能滿足臨床檢測的需求。