不同溫光條件對海島棉愈傷組織誘導的影響

孫 陽 李 欣 胡超越

（塔里木大學生命科學學院/新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

新疆作為海島棉的主要生產區，因氣候、環境、土壤等特點，需要培育抗鹽、抗旱、耐高溫的品種，通過轉基因技術改良海島棉品種對新疆鹽漬化的適應性，是一種快速有效的手段，而這需要組織培養技術支持，因此海島棉穩定再生體系的建立尤為重要[1-2]。目前，棉花組織培養、轉基因的研究棉種主要是陸地棉[3]、克勞茨基棉[4]等。本研究的棉種是海島棉，是目前所報道的可以再生的棉花品種中較難再生的一種，存在胚狀體萌發率偏低、畸形苗率較高[5]、再生周期長[6]、生根困難[7]、缺少內源激素含量水平與最適外源激素濃度之間的關系探討[8]等問題。

在植物組織培養中，培養溫度、是否光照等因素對愈傷組織誘導有不同的影響。這些差異會導致外植體生理生化狀態差異，從而影響組織培養的形態發生。本研究以3個新疆主栽海島棉品種的下胚軸為外植體，設置不同溫度、光照條件，分析不同條件對海島棉品種愈傷組織形態、出愈率等的影響，為建立海島棉高效再生體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆海島棉品種：新海21、新海40、新海44，均由新疆阿拉爾市種子市場購買。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

選取3個新疆海島棉品種在3種光照（全光照、交替光照、全黑暗）、2種溫度（25℃、28℃）條件下誘導愈傷組織形成，重復3次。觀察比較愈傷組織形成快慢、大小、顏色、質地等形態特征，并統計出愈率。試驗采用雙因素完全隨機設計。

1.2.2 測定項目及方法

選取成熟飽滿的海島棉種子，每個品種的海島棉種子各取50粒，在超凈工作臺上用無菌水沖洗1次，75%乙醇溶液消毒30 s，無菌水沖洗1次，用2%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗3次。待種子干燥后接種于裝有1/2 MS培養基上，每瓶培養基上接種4～5粒種子，移入培養室中，置于28℃下全光照培養，以期獲得7 d的無菌苗備用。

選取健康幼苗下胚軸，在超凈工作臺上切成0.8～1 cm大小的段作為外植體，接種于MS（4.74 g/L MS培養基+30 g/L葡萄糖+7.5 g/L瓊脂粉）、輔以激素0.1 mg NAA+0.1 mg KT的愈傷組織誘導培養基上。激素均在滅菌前加入培養基，pH 6.5，121℃高壓滅菌20 min。每個處理接種10～12個外植體，重復三次。培養溫度為25℃、28℃，光照設置參考黃莉雅[9]略作調整，設置光照培養、光照黑暗交替培養（光照2周+黑暗2周交替處理）、黑暗培養，光照強度1 500～2 000 Lx。

持續觀察愈傷組織的生長量，愈傷組織的顏色及類型和疏松愈傷組織細胞形態，并統計25 d出愈率：

愈傷組織出愈率（%）=（形成的愈傷組織數/接種的外植體數）×100。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010和DPS（9.01）軟件對愈傷組織誘導培養結果進行統計分析并繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同培養條件對海島棉愈傷組織形態的影響

本試驗設置不同溫度、光照條件對3個海島棉品種進行愈傷組織誘導，結果表明：3個海島棉品種愈傷組織顏色以黃綠色、綠色為主，其次為黃色，質地多為疏松（圖1，A-F）。在25℃、全光照條件下，新海21愈傷組織顏色則為黃色質地疏松（圖1，E）；25℃、交替光照條件下，新海40、新海44愈傷組織顏色多為白色、少數為綠色，且質地多為疏松部分質地緊致（圖1，F、I）。在28℃、全光照條件下，新海21愈傷組織為黃綠色質地疏松（圖1，D）；28℃、交替光照條件下，新海21、新海40愈傷組織顏色以白色為主、部分為綠色，且質地多為疏松（圖1，G、H）。25℃和28℃黑暗條件下進行愈傷組織誘導，新海21誘導出愈傷組織均為白色且質地疏松（圖1，N、O），新海40則兩端呈黑色，未出現愈傷組織（圖1，J、K）。通過以上分析，新海21相比新海40和新海44在不同的溫光條件下更容易形成顏色和質地較優的愈傷組織。

圖1 海島棉愈傷組織顏色、形態

2.2 不同溫度對愈傷組織形成的影響

在全光照、交替光照條件下，3個海島棉品種在不同溫度條件下愈傷組織形成速度不同，28℃培養溫度出愈時間較早，9天左右即肉眼可見明顯愈傷組織，愈傷組織主要發生在外植體兩端，顏色多為綠色（圖1，A）。25℃培養溫度出愈時間較晚，11天左右即肉眼可見明顯愈傷組織，顏色多為白、綠色（圖1，B、C）。從愈傷組織形成快慢、形態等方面觀察，在光照條件一定的情況下，28℃對海島棉愈傷組織生長速度有一定的促進作用，形成的愈傷組織顏色、質地更優于25℃培養條件。

將相同光照條件下3個海島棉品種在2種溫度下的出愈率進行差異顯著性分析。全光照條件下（圖2，A），新海21、新海40在2種溫度下的出愈率差異顯著；新海44在2種溫度下的出愈率差異未達到顯著水平。交替光照條件下（圖2，B），新海21在2種溫度下的出愈率差異顯著，而新海40、新海44在2種溫度下出愈率差異不顯著。在黑暗條件下（圖2，C），3個海島棉愈傷組織誘導效果較差，只有新海21形成愈傷組織，在28℃和25℃條件下出愈率分別為12.22%、11.94%，新海40、新海44在2種溫度下出愈率均為0。3個海島棉品種2種溫度下的出愈率差異均表現不顯著。

通過以上分析，相比較新海40、新海44，新海21在相同光照條件下誘導愈傷組織對溫度比較敏感，3個海島棉品種在28℃時誘導愈傷組織形成較快、質地較好。

圖2 相同光照條件下2種溫度出愈率比較

2.3 不同光照對愈傷組織形成的影響

全光照條件下，海島棉以黃綠色、綠色愈傷組織為主，比交替光照條件下形成的愈傷組織多，且形成快（圖1，A-E）。交替光照條件下出現了白色的愈傷組織，質地多為緊致（圖1，F-I），黑暗條件下新海40、44未形成愈傷組織，新海21形成少量愈傷組織，出愈率明顯低于全光照培養和交替光照培養，且差異達到顯著水平。黑暗條件外植體容易誘發根毛生長，愈傷組織多為白色，外植體兩端呈現黑色（圖1，J-O）。

在溫度一定的情況下，對3個海島棉品種不同光照條件下出愈率進行差異顯著性分析（見圖3）。在溫度為28℃時（圖3，A），3個海島棉品種全光照和交替光照出愈率差異均不顯著，但與黑暗條件下出愈率差異達到顯著水平。溫度為25℃時（圖3，B），新海21在全光照、交替光照、黑暗條件下出愈率間差異均達到顯著水平；新海40交替光照出愈率高于全光照，新海44則相反，但出愈率差異均不顯著，新海40和新海44在全光照、交替光照條件下出愈率與黑暗條件下出愈率差異達到顯著水平。通過以上分析，光照對海島棉愈傷組織形成及形態、顏色、出愈率等影響較大。本試驗3個海島棉品種出愈率在全光照、交替光照下多數表現出為差異不顯著；綜合愈傷組織形態觀察，全光照較交替光照更有利于愈傷組織形成；黑暗條件下愈傷組織形態較差或未形成愈傷組織，即不利于海島棉愈傷組織的形成。

圖3 相同溫度條件下3種光照出愈率的比較

2.4 不同基因型對愈傷組織形成的影響

3個品種海島棉形成以黃色、黃綠色、綠色為主，質地多為疏松的優質愈傷組織（圖1，A-E）。在相同溫度、光照條件下，新海21愈傷組織以黃色、質地疏松為主，生長速度較快，愈傷組織成塊較大；新海40和新海44愈傷組織以綠色、質地緊致為主，生長速度較慢，愈傷組織成塊較小（圖1）。

在全光照和交替光照條件下，3個海島棉品種（基因型）在2種溫度下均可以形成愈傷組織，但出愈率不同，黑暗條件下，只有新海21形成少量愈傷組織（圖4）。在光照和溫度一致的條件下，對3個品種（基因型）的海島棉出愈率進行差異顯著性分析。在28℃（圖4，A）時，全光照條件下，新海21出愈率低于新海40、新海44的出愈率且差異顯著；交替光照條件下，3個品種的出愈率差異不顯著；黑暗條件下，新海40、新海44的出愈率為0，且與新海21的出愈率差異達到顯著水平。在25℃（圖4，B）時，全光照條件下，新海40的出愈率低于新海21、新海44的出愈率且差異顯著；交替光照條件下，新海21出愈率低于新海40、新海44的出愈率且差異顯著；黑暗條件下，新海40、新海44出愈率為0且與新海21的出愈率差異達到顯著水平。通過以上分析，3個海島棉品種在相同條件下誘導的愈傷組織形態、出愈率表現不同。新海21出愈率與新海40、新海44出愈率差異大部分達到顯著水平，而新海40和新海44出愈率差異大部分表現不顯著。說明基因型對海島棉愈傷組織形態、愈傷組織誘導快慢、出愈率等均有一定的影響。

圖4 相同溫度、光照條件下3個品種出愈率的比較

3 結論與討論

植物組織培養中，光溫條件是影響生長發育的關鍵因子，不同的培養條件對海島棉愈傷組織發生及形態的影響有較大差異。本研究以海島棉新海21、40、44下胚軸為外植體材料，愈傷組織誘導階段在培養基中添加0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT時，出愈率可達90.26%～97.31%，愈傷組織顏色以黃綠色、綠色為主，質地多為疏松，黑暗條件下新海40、新海44未形成愈傷組織。3個品種愈傷組織培養可能更適應溫度為28℃、全光照的培養條件。

（1）李占岐等[10]人研究表明“湘棉-18”莖尖培養時，最適培養溫度為26℃～29℃，低于24℃愈傷組織生長緩慢，不利于植株生長發育。顧冉冉等[11]、師海榮等[12]研究結果為新陸早33及百棉1號愈傷組織誘導溫度均為（28±1）℃。本試驗結果表明28℃相比于25℃更有利于海島棉新海21、40、44形成愈傷組織，這與以上研究結果基本一致。

（2）光照能夠誘導植物組織形態的建成，影響離體培養細胞的增殖和器官的分化，對外植體細胞最初分裂的影響更為顯著[13]。本研究結果顯示，在暗培養條件下海島棉愈傷組織誘導階段出愈率明顯低于光照培養和交替培養，這與劉艷等[14]人研究紫蘇愈傷組織誘導結果基本一致。李占岐等[10]人研究表明，暗培養的“湘棉-18”外植體比光照下的易形成愈傷和胚狀體，而且光照對生根的影響較大。而本研究中黑暗條件對海島棉新海21、40、44的愈傷組織的形成有一定的抑制作用，抑制原因有待進一步研究，但本實驗中海島棉黑暗條件外植體容易誘發根毛生長這與李占岐等人研究結果相似。本試驗結果顯示交替培養雖然出愈率與全光照培養相差不大，但是誘導效果不及全光照培養，顏色質地差異較大，可能是光照對海島棉愈傷組織某些酶活性和葉綠體代謝產物存在一定影響，從而影響愈傷組織色素合成。前人研究發現，新陸早33、45、50及柯字棉312先暗處理后光處理更有利于棉花下胚軸愈傷組織發生[15-16]。這可能是不同的植物組織生長、發育受光照的調節機制不同所致[17]。本研究未對先黑暗后光照、一天內光照交替條件下愈傷組織誘導效果進行研究，并且光處理時光強、光質、光周期對海島棉愈傷組織形成的影響，也有待進一步探討。

（3）在不同溫度、光照條件下誘導的海島棉愈傷組織表現不同，除了溫度、光照對愈傷組織形態、愈傷組織形成快慢、出愈率有著不同程度的影響，還可能存在基因型與之互作，本試驗的3個海島棉品種（基因型）數量少，不同基因型與溫度、光照對愈傷組織形成的影響是否存在互作、互作大小等，還需要對更多不同基因型海島棉進行深入地研究。