β-珠蛋白基因CAP位點(diǎn)下游+43_+40（-AAAC）突變的臨床特征分析

王繼成 杜麗 姚翠澤 秦丹卿 郭浩

地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）是一組常見于我國(guó)南方地區(qū)的遺傳性溶血性疾病，主要分為α-地貧和β-地貧兩類。β-地貧是由于β-珠蛋白基因（hemoglobin subunit beta，HBB）上編碼區(qū)或非編碼區(qū)序列上的突變而引起β-珠蛋白肽鏈合成減少或缺失。與缺失型多見的α-地貧不同，β-珠蛋白基因點(diǎn)突變是導(dǎo)致β-地貧的主要原因。目前臨床上多使用液相芯片技術(shù)或聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交的方法（PCR-RDB）檢測(cè)中國(guó)人最常見的17 種β-珠蛋白基因突變［1-3］，其中就包括HBB：5′UTR+43_+40（-AAAC），這種突變通常又被稱為CAP 突變。1991年首次報(bào)道了中國(guó)人有此突變會(huì)導(dǎo)致β-地貧［4］，但此后多項(xiàng)研究通過(guò)描述攜帶此突變的幾個(gè)病例或幾個(gè)家系的病例的臨床表現(xiàn)，認(rèn)為CAP 突變可能只是一種多態(tài)性，并不具有明顯的生物學(xué)效應(yīng)［5-6］。然而對(duì)于CAP 突變的遺傳效應(yīng)的認(rèn)識(shí)，需要分析更多的雜合子以及復(fù)合其他地貧病例的血液學(xué)表現(xiàn)，才更具代表性。因此本研究收集CAP 突變病例，并對(duì)相關(guān)血液學(xué)參數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年至2019年就診或送檢于廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，經(jīng)珠蛋白基因檢測(cè)確診為HBB：5′UTR+43_+40（-AAAC）突變的39 例患者。所有病例均為廣東籍，年齡為（0.5～40）歲，男女比例為15∶24。對(duì)于合并其他β-珠蛋白基因突變的病例，通過(guò)對(duì)其家系的遺傳分析來(lái)排除兩種突變發(fā)生在同一條染色體的情況。排除標(biāo)準(zhǔn)：①紅細(xì)胞結(jié)果明顯異常提示有其他少見的珠蛋白基因突變可能的病例；②通過(guò)血清鐵蛋白檢測(cè)顯示為缺鐵性貧血的病例。

1.2 研究方法

1.2.1 紅細(xì)胞參數(shù)分析

收集患者的外周血，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本希森美康株式會(huì)社，型號(hào)：SYSMEX XS-1000i）對(duì)外周血進(jìn)行包括血紅蛋白量Hb 及MCV、MCH 等紅細(xì)胞參數(shù)分析。采用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀（法國(guó)Sebia 公司，Capillary 2 Flex Piercing）完成血紅蛋白組分的分析。

1.2.2 珠蛋白基因診斷

采用QIAmp DNA Blood Mini Kit 試劑盒（QIAGEN 公司）提取外周血基因組DNA。應(yīng)用PCR-流式熒光雜交法檢測(cè)3 種常見的缺失型（--SEA、-α3.7、-α4.2）和3 種點(diǎn)突變型α-地貧（CS、QS、WS）及17 種β-地貧突變，地中海貧血（α/β型）基因檢測(cè)試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。使用Sanger 測(cè)序法對(duì)常規(guī)基因檢測(cè)顯示陽(yáng)性的病例進(jìn)行進(jìn)一步確定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用（%）表示。CAP 突變合并β-地貧組病例的參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的β0-地貧雜合子病例的參數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20 例β-珠蛋白基因CAP 突變的雜合子病例的血液學(xué)參數(shù)

20 例CAP 突變的雜合子均無(wú)貧血癥狀，Hb 平均值為（139.05±19.36）g/L。除病例10 外，MCV、MCH 等血液學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，其平均值分別為MCV：（88.68±3.94）fL 和MCH：（29.69±1.72）pg。HbA2的比值為（2.63±0.20）%。見表1。

2.2 9 例β-珠蛋白基因CAP 突變復(fù)合β 地貧病例的血液學(xué)參數(shù)

與β0-地貧雜合子相似，CAP 突變復(fù)合β0-地貧時(shí)依然只有輕度的小細(xì)胞低色素性貧血的表現(xiàn)（Hb：89-139 g/L），MCV、MCH 和HbA2的水平與文獻(xiàn)報(bào)道［7］的β0-地貧雜合子（MCV：64.98±3.89fL，MCH：20.30±1.23pg，HbA2：5.56±0.89）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 10 例β-珠蛋白基因CAP 突變合并α 地貧病例的血液學(xué)參數(shù)

當(dāng)CAP 突變合并α-地貧時(shí)，其血液學(xué)參數(shù)的數(shù)值與單純的α+或α0-地貧相比也無(wú)明顯的差異。見表3。

3 討論

β-珠蛋白基因5′UTR 的范圍包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間約50bp 大小的區(qū)域，其間已發(fā)現(xiàn)了多種變異，已被HbVar 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的包括+43_+40（-AAAC）、CAP +1（A＞C）、+10（-T）、+20（C＞T）、+22（G＞A）、+33（C＞G）、+45（G＞C）等7 種突變［8］。臨床上通常使用紅細(xì)胞參數(shù)分析結(jié)合血紅蛋白電泳來(lái)篩查地貧，對(duì)于MCV＜82 fL 或MCH＜27 pg 及Hb A2＞3.5%的病例考慮是β-地貧的可能后再進(jìn)行珠蛋白基因檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步確診。而β-珠蛋白基因5′UTR 區(qū)域的突變雜合子多無(wú)血液學(xué)指標(biāo)的明顯異常，所以涵蓋在5′UTR 區(qū)域的+43_+40（-AAAC）突變就不容易被發(fā)現(xiàn)。因此，收集多例此突變的病例，可對(duì)其血液學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析提供可能。

表1 20 例β-珠蛋白基因CAP 突變的雜合子病例的血液學(xué)參數(shù)Table 1 Hematological parameters of 20 cases of Heterozygote CAP mutation of HBB

表2 9 例β-珠蛋白基因CAP 突變復(fù)合β-地貧病例的血液學(xué)參數(shù)Table 2 Hematological parameters of 9 cases of CAP mutation combined with β-thalassemia

表3 10 例β-珠蛋白基因CAP 突變合并α-地貧病例的血液學(xué)參數(shù)Table 3 Hematological parameters of 10 cases of CAP mutation combined with α-thalassemia

國(guó)外已有在體外從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)這些突變的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究的報(bào)道，并且認(rèn)為β-珠蛋白基因5′UTR 區(qū)域的突變多數(shù)只是沉默的突變，并不具有顯著的遺傳效應(yīng)［9-10］。這與本研究結(jié)果相互驗(yàn)證。中間型β-地貧的基因缺陷主要為β+/β0和β+/β+兩種。這種類型的β-地貧的貧血程度和相關(guān)的血液學(xué)指標(biāo)有很大的差異，可有輕度到中重度的貧血［11］。HbVar 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的幾種β-珠蛋白基因5′UTR 區(qū)域的突變多數(shù)顯示為β+-地貧，當(dāng)其合并其他β0-地貧突變時(shí)，應(yīng)該表現(xiàn)為中間型β-地貧。另外，由于α-地貧的貧血程度與α/β-珠蛋白肽鏈比例失衡的程度成正相關(guān)［12］，所以當(dāng)α-地貧合并β-地貧時(shí)，其貧血情況應(yīng)該會(huì)有改善。所以從CAP 突變雜合子以及復(fù)合α-地貧或β-地貧時(shí)的血液學(xué)表現(xiàn)來(lái)看，此突變很可能只是一種多態(tài)性改變。至于本突變的首例報(bào)道的患兒因重型地貧而死亡，推測(cè)可能當(dāng)時(shí)由于檢測(cè)水平的限制，患兒攜帶的另一種少見的β-地貧突變沒有被發(fā)現(xiàn)，從而誤判CAP 突變是一種致病突變。

我國(guó)的南方省份是地貧的高發(fā)區(qū)，其中臨床上常規(guī)檢測(cè)的17 種β-珠蛋白基因突變占我國(guó)南方地區(qū)全部β-珠蛋白基因突變類型的95%以上［13-14］。但是對(duì)于CAP 突變這種沒有遺傳效應(yīng)的突變，可考慮排除在常規(guī)地貧檢測(cè)范圍內(nèi)，從而納入其他的熱點(diǎn)突變。由于沒有理想的治療方法，婚前、孕前和產(chǎn)前篩查是預(yù)防中重型地貧患兒出生的最有效措施。臨床上，通常先對(duì)夫妻雙方同時(shí)進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)和血紅蛋白電泳分析，若任一方紅細(xì)胞參數(shù)和血紅蛋白組分有異常，夫妻雙方同時(shí)進(jìn)行地貧基因檢測(cè)［15-16］。如果夫妻雙方分別被診斷為β0-地貧和CAP 突變雜合子，這時(shí)準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)和理解CAP 突變的遺傳效應(yīng)，對(duì)產(chǎn)前診斷以及遺傳咨詢可以提供重要的參考。

本研究通過(guò)對(duì)CAP 突變病例的血液學(xué)特征的分析判斷CAP 突變是一個(gè)沒有遺傳效應(yīng)的多態(tài)性位點(diǎn)。臨床檢驗(yàn)實(shí)踐中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的突變類型時(shí)，查找復(fù)合其他位點(diǎn)的突變、運(yùn)用分子學(xué)方法預(yù)測(cè)突變的意義以及通過(guò)臨床病例的分析總結(jié)，可初步判斷此突變的生物學(xué)效應(yīng)。