血清人表皮生長因子受體2水平在乳腺腫瘤診斷與治療中的應用

王璐，沈國棟，顧朋穎，張永，歐陽歡，胡世蓮

[1.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院南區(qū)(安徽省立醫(yī)院南區(qū))老年醫(yī)學科，合肥 230036；2.蚌埠醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院；3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科]

在我國女性中，乳腺癌是最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率的增長速度超過了世界平均增長水平。據(jù)報道，2011年我國城市女性人群乳腺癌發(fā)病是46.74/10萬,死亡率是10.14/10萬,分別排位在女性癌癥發(fā)病率及死亡率的第1位和第5位,這些數(shù)據(jù)提示乳腺癌已成為危害我國女性人群健康的首要殺手，嚴重威脅著女性的生命健康[1]。目前臨床上對腫瘤的病程以及預后主要依據(jù)腫瘤體積和組織學分級，病理學分級和腫瘤轉移狀況等。最近分子診斷技術對乳腺癌的診斷和預后檢測越來越重要，有研究發(fā)現(xiàn)，25%～30%的浸潤性乳腺癌患者有人表皮生長因子受體2(HER2)基因擴增或蛋白過表達[2]，提示著 HER2 為乳腺癌診斷和治療提供了一個方向。

研究證實在人17號染色體q21位置上發(fā)現(xiàn)了鼠neu基因的同源物，它被命名為HER2/neu(erbB-2),其編碼了一個分子量為185 kDa 的跨膜受體酪氨酸激酶。HER2 蛋白是一個跨膜受體，其中包括胞外段、跨膜區(qū)域段及胞內的絡氨酸激酶區(qū)域段。HER2基因擴增與細胞分化、局部及遠處轉移、遷移、減少細胞凋亡、加快血管發(fā)生、腫瘤侵襲、局部及遠處轉移密切相關。HER2在乳腺癌、胃癌及非小細胞肺癌等多種腫瘤中高表達，檢測腫瘤組織HER2 表達水平已作為一個獨立指標用于腫瘤的臨床診斷和治療中[3-4]。用免疫組織化學和熒光原位雜交的方法對侵襲性早期乳腺癌的患者的腫瘤組織進行檢測，有20%～25%的患者HER2高表達。雖然用于檢測組織中HER2 的方法準確性較強，但這些傳統(tǒng)的HER2 檢測主要通過檢測腫瘤組織，具有一定的創(chuàng)傷性而且不適用于手術后檢測和多次監(jiān)測患者體內HER2的水平變化。現(xiàn)大量研究表明，整體的HER2其胞外區(qū)域段ECD片段(p97-115 kDa)可從細胞表面脫落進入血液循環(huán)中，其基礎值的高低及其HER2水平的變化不僅可以預測患者對治療的反應程度、無病生存期、病理完全緩解期等等，而且可以比臨床上提前2～3個月診斷乳腺癌的發(fā)生。由此可見監(jiān)測乳腺癌患者血清中HER2 水平對臨床中腫瘤的診斷和治療有著重要的意義[5-6]。但目前國內尚缺乏高靈敏檢測血清HER2的試劑盒，且監(jiān)測乳腺癌患者病程中HER2水平變化的研究很少。

本研究使用課題組前期研制的用于檢測高靈敏血清HER2水平的ELISA試劑盒(專利號：ZL201610695316.6)，為乳腺癌的診斷和療效評估提供依據(jù)，同時也為臨床應用奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科、乳腺外科及體檢中心，安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科及蚌埠醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科于2013年1月至2014年12月的研究對象共186例。186例包括：20例健康體檢者、67例乳腺包塊患者(包括乳腺增生、良性纖維腺瘤)、40例早期乳腺癌患者(即根據(jù)TNM分期的Ⅰ—Ⅱ期患者)及59例轉移性乳腺癌患者(即根據(jù)TNM分期的Ⅲ—Ⅳ期患者)，研究對象均為女性，年齡為30～70歲，四組年齡構成比相同，收集患者晨間空腹血清標本，獲取病例資料，所有患者簽署知情同意書。

1.2 實驗儀器 用于檢測人血清HER2含量的ELISA試劑盒(專利號：ZL201610695316.6,臨界值：10 μg/L)；單人超凈工作臺 (中國蘇州凈化公司產(chǎn))；臺式低速離心機 (美國Beckman公司產(chǎn))；4 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱(德國Siemens公司產(chǎn))；ELX-800酶標儀(美國BIO-TEK公司產(chǎn))；振蕩器(中國江蘇金城國勝實驗儀器廠產(chǎn))；臺式高速離心機(美國Beckman公司產(chǎn))；4 ℃高速離心機 (美國Beckman公司產(chǎn))；FA1104型電子分析天平 (中國上海精密科學儀器有限公司產(chǎn))。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 用100 μL的E9-Sc或曲妥珠單抗鋪板，放4 ℃冰箱過夜。在37 ℃的條件下用300 μL的5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。用T-PBS洗板3次后加梯度稀釋的抗原，每孔100 μL。(標準品：梯度稀釋的ECD；稀釋的血清樣品)，放在常溫中振蕩1 h。用T-PBS洗板3次后加入稀釋的Biotin-A18抗體100 μL，常溫下振蕩1 h。用T-PBS洗板3次后加入稀釋的辣根過氧化物酶，每孔100 μL，常溫下振蕩30～40 min。用T-PBS洗板3次后每孔加入100 μL TMB或OPD顯色液100 μL，避光顯色，注意觀察顏色變化。適時的用1M硫酸終止反應。用酶標儀在450 nm或490 nm的條件下顯色。

2 結果

2.1 術前各類樣本血清HER2水平比較 健康對照組的血清HER2水平明顯低于乳腺包塊組、早期乳腺癌組以及轉移性乳腺癌組，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 不同治療方案的患者術后血清HER2水平比較 病理結果顯示：HER2陽性且術后化療的患者共56例(37例來自早期乳腺癌組，19例來自轉移性乳腺癌組)。對發(fā)生術后轉移的患者追蹤觀察發(fā)現(xiàn)：術后未用曲妥珠單抗治療的患者其血清HER2平均值[(10.92±6.4)μg/L]明顯高于用曲妥珠單抗治療的患者[5.13±0.52 μg/L]，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.771，P<0.001)。

表1 各組的血清HER2水平

2.3 術后化療患者的HER2水平與癌胚抗原(CEA)的相關性 對病理結果顯示HER2陽性且術后化療中的7位患者血清行多次檢測，分析發(fā)現(xiàn)其中有5位患者血清HER2的水平與CEA呈正相關(r=0.496，P<0.001),與CA153無相關性(r=0.204，P=0.135)。

3 討論

目前尚缺乏統(tǒng)一的無創(chuàng)性乳腺疾病早期診斷和療效評價方法。本研究使用了團隊專利HER2高靈敏試劑盒，發(fā)現(xiàn)轉移性及早期乳腺癌以及乳腺包塊患者血清中的HER2水平較健康者均明顯升高。在轉移性乳腺癌患者中，術后未用曲妥珠單抗治療者的血清HER2水平明顯高于術后使用曲妥珠單抗治療的患者，同時也發(fā)現(xiàn)血清HER2值與臨床腫瘤標志物之間呈現(xiàn)正相關性。該研究表明檢測血清HER2水平對乳腺疾病的診斷有較好的臨床價值，同時可以用于評價曲妥珠單抗對乳腺腫瘤的治療效果。

研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、非小細胞肺癌、卵巢癌以及其他癌癥患者及心力衰竭的患者中均有血清HER2升高，而且在這些患者的唾液中也檢測到了可溶性HER2的存在,并指出HER2水平在這些疾病診斷與治療中有重要意義[3-4,7-8]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，約18.5%的早期乳腺癌及43%的轉移性乳腺癌患者有血清胞外段可溶性的HER2升高。本研究進一步發(fā)現(xiàn)乳腺包塊患者、早期乳腺癌患者及轉移性乳腺癌患者的血清HER2較健康人有明顯著升高。王新樂等[10]用曲妥珠單抗輔助治療HER2 陽性晚期轉移性乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)，治療前血清 HER2 水平明顯高于治療1年后HER2 水平，另外還發(fā)現(xiàn)血清 HER2 水平與治療效果呈負相關關系。本研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌術后使用曲妥珠單抗治療的患者血清中HER2水平明顯低于未用曲妥珠單抗的患者，還發(fā)現(xiàn)血清中HER2水平與CEA呈正相關，這些發(fā)現(xiàn)均表明血清HER2可以用于乳腺疾病的早期診斷和療效評估，同時可以用于評價曲妥珠單抗對乳腺腫瘤的治療效果。