庚基靈菌紅素高產菌株Notoacmeibacter sp.BGMRC2072的常壓室溫等離子體誘變(ARTP)選育*

蘇志維，盧天梅，趙美婷，李艷梅，劉玉英，高程海，劉永宏

(廣西中醫藥大學海洋藥物研究院， 廣西南寧 530200)

0 引言

靈菌紅素類色素是一類由微生物次級代謝所產生的，具有3個吡咯環母核結構的天然紅色素的總稱[1]，根據其側鏈烷基的長短及環化位置不同可分為多種結構類似物，包括靈菌紅素、庚基靈菌紅素、十一烷基靈菌紅素、環烷基靈菌紅素、間環丙菌素、鏈玉紅菌素B等[2]。靈菌紅素是三吡咯類微生物色素的典型代表，研究人員已分離到很多產靈菌紅素類物質的微生物，其中沙雷氏菌[3]、假單胞菌[4]、河氏菌[5]、弧菌[6]等是主產靈菌紅素的菌屬。庚基靈菌紅素是靈菌紅素的結構類似物，其區別僅在于吡咯C環的3-位烷基側鏈被庚基取代。目前，僅有為數不多的菌株如Pseudovibriodenitrificans[7]、P.magnesiorubra[8]和Vibriogazogenes[9]被報道可產庚基靈菌紅素，且產量極低，如主產靈菌紅素的細菌P.magnesiorubra，其產生的庚基靈菌紅素的比例僅占總代謝物的1%[7]。現代藥理研究發現，靈菌紅素及其類似物具有廣泛的生物活性，在醫藥、化妝品、環境治理、紡織染料等領域具有廣闊的應用前景和市場價值[1,2,10-13]。

目前針對產靈菌紅素菌種誘變改良的方法較多，包括利用紫外或微波技術處理的物理誘變法[4,14]、用EMS處理的化學誘變法[5]和復合誘變法[15]等。張德偉等[16]采用常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)誘變篩選靈菌紅素生產菌突變株，使靈菌紅素產量比誘變前提高1.23倍。與其他誘變育種手段相比，利用ARTP進行微生物誘變育種可造成DNA多樣性損傷，且具有操作簡便、成本低、無有毒有害物質參與誘變過程、突變率高等優點，并易獲得遺傳穩定性良好的突變株[17]。目前尚未有關于使用ARTP誘變篩選庚基靈菌紅素高產菌株的方法報道。前期研究發現一株非致病性的海洋細菌Notoacmeibactersp.BGMRC2072(簡稱C9)，其主要代謝產物為庚基靈菌紅素，對高溫、紫外線照射具有較強的抗性[18]。為了使海洋細菌C9能更高效、大量合成庚基靈菌紅素，本研究以C9為出發菌株，利用ARTP進行誘變，并結合遺傳穩定性測試，篩選穩定高產庚基靈菌紅素的菌株，為庚基靈菌紅素的生產發酵、現代藥理研究提供理論依據和技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

酵母粉、麥芽提取粉、葡萄糖和瓊脂(廣州環凱微生物科技有限公司)，海鹽(廣東鹽業集團有限公司)，甲醇、丙酮和鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.2 菌種

海洋細菌C9來源于廣西防城港怪石灘的海綿，經16S RNA測序鑒定為Notoacmeibacter屬的一個種，本實驗室選育保藏，編號為BGMRC2072。

1.1.3 培養基

改良ISP2液體培養基(1 L)：酵母粉0.2%，麥芽提取粉0.2%，葡萄糖0.2%，海鹽3%，加水溶解后121℃高壓滅菌20 min。固體培養基在此基礎上添加1.3%瓊脂。

1.1.4 主要儀器

高壓滅菌鍋(日本PHCbi，型號：MLS-371L-PC)，萬分之一電子分析天平(廣州梅特勒，型號：ML204T)，DHG-9246A電熱鼓風干燥箱和SHP-250生化培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，可見分光光度計(上海精科電子有限公司，型號：721G)，常溫等離子誘變育種儀(無錫源清天木有限公司，型號：APTR-lls)，臺式高速離心機(立日本日)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-2F)，純水機(四川優普超純科技有限公司，型號：UPH-ll-JDZB)，手動移液槍(艾本德國際貿易有限公司，型號：Eppendorf-100/1000型)，恒溫振蕩器(蘇州精騏有限公司，型號：IS-RDS3)。

1.2 方法

1.2.1 菌體干重及比生長速率測定

結合Tu等[19]和Cao等[20]的方法，利用分光光度法測定600 nm處的光密度值(OD600)及菌體干重(CDW)來衡量菌體的生長情況。收集待測菌液加入離心管中，10 000 r/min 快速離心5 min收集菌體，棄上清，菌體用蒸餾水清洗3遍，100℃干燥至恒重。

菌體的比生長速率μ=(lnWt-lnW0)/T，

其中，W0和Wt分別代表進入對數生長期的菌體OD600初始值和最終值，T代表培養時間(h)。

1.2.2 ARTP誘變處理方法

(1)ARTP誘變致死曲線

將菌種從-80℃超低溫冰箱中取出，轉接至改良ISP2固體培養基平板上，28℃培養2—3 d后，挑取單菌落轉接至改良ISP2液體培養基中，于28℃、180 r/min培養30—40 h至對數生長期。收集菌液，10 000 r/min 快速離心5 min，棄上清，用5%甘油生理鹽水重懸，分光光度計測量菌懸液OD600為0.6—0.8。取10 μL菌懸液至ARTP誘變金屬載片上進行誘變，以99.99% 氦氣作為工作氣體(流量10 mL/min)，在電源功率115 W的條件下分別誘變處理0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，105 s。誘變結束后用5%甘油生理鹽水稀釋，分別取10-4、10-5和10-63個濃度的菌液100 μL涂布于改良ISP2固體培養基平板上，置于28℃培養2—3 d后記錄每皿菌落數，計算誘變致死率，繪制致死率曲線。

(2)誘變時間確定

結合張德偉等[16]和Cao等[20]的方法，綜合考慮不同生長階段的正負突變率及比生長速率，確定最佳誘變時間。若突變菌株的考察指標值(菌落形態、顏色、OD600、比生長速率等)高于原始菌株視為正突變，反之則視為負突變。

1.2.3 突變菌株的篩選

在最佳處理時間下誘變后，根據平板上菌落的生長狀況挑取生長大而豐滿、色澤鮮艷、菌落直徑較大的單菌落，接種于裝有50 mL 改良ISP2液體培養基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min 培養34 h。利用分光光度法測定菌體的OD600并觀察菌體顏色、形態進行初篩，再通過測定初篩突變菌株的庚基靈菌紅素含量進行復篩，最后將復篩得到的突變菌株接種發酵，以菌體生物量為指標篩選優勢突變菌株。

1.2.4 庚基靈菌紅素的提取與檢測

取1 mL培養至34 h的菌體發酵液，加入9 mL酸性甲醇(pH=3)，震蕩破壁，10 000 r/min 快速離心5 min，至菌體基本無色，取上清液稀釋至合適濃度后，用分光光度計檢測536 nm處的吸光值。庚基靈菌紅素含量的計算公式為

庚基靈菌紅素含量(μg/mL)=(19.076×

OD536+0.800)×D×V，

其中，D為色素浸提液的稀釋倍數，V為發酵液的體積(mL)。

1.2.5 突變菌株的穩定性

將復篩得的突變菌株接種于改良ISP2固體培養基上，連續培養10代，再分別轉接到改良ISP2液體培養基中發酵培養，并測定10代菌種的庚基靈菌紅素產量，考察突變菌株的遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變致死曲線

如圖1所示，致死率隨著誘變時間的增加而增大，當處理時間延長到40 s后，ARTP誘變導致的菌株致死率上升緩慢；當處理時間延長到50 s后，菌株的致死率達90%以上且趨于平緩；誘變時間大于60 s后致死率小幅度回落。現代育種研究表明，致死率達到90%以上時，菌株正突變概率大大增加[21]。但由于在只知致死率大小的情況下，無法判斷50，60，70 s中哪個處理時間點造成正突變的概率最大，因此還需結合這3個時間段的正負突變率來綜合考慮最終選擇的誘變處理時間。

2.2 最佳突變時間

選擇菌體生長初始期、對數生長期及穩定期3個階段綜合考察菌體突變情況，結果如圖2所示，當處理50 s時，對數生長期的正突變率最高，但初始期的正突變率較低；當處理70 s時，初始期的正突變率最高，但對數生長期的正突變率最低；只有處理時間為60 s時，初始期、穩定期、對數生長期的正負突變率都較均衡。經綜合考慮，最終選擇60 s作為突變處理時間。

圖1 ARTP誘變致死率曲線

圖2 不同處理時間的正負突變率

2.3 突變菌株篩選

A、B兩組出發菌株經ARTP平行誘變處理60 s后，根據菌落生長情況挑取生長大而豐滿，色澤鮮艷的菌落，接種發酵后測定菌液OD600，并觀察菌體顏色深淺，初篩得到35株OD600高于出發菌株且發酵顏色較深的突變株，測定其庚基靈菌紅素含量進行復篩，結果如圖3所示。根據文獻[20]，選擇與出發菌株相比產量增加20%以上的菌株作為正突變篩選范圍，可以看出庚基靈菌紅素產量超過20%的菌株有A6、A7、A10、A11、A13、B4、B5、B6、B10、B13共10株。

將上述篩選的10株突變菌株接種發酵，以生物量為指標篩選優勢突變菌株，如圖4a所示，大多數突變菌株在穩定期OD600與比生長速率無較大差別，而A11和B10這兩株突變菌株在穩定期OD600和比生長速率明顯低于其他平行突變菌株，生長穩定性欠佳。結合突變菌株菌體生物量(圖4b)，除了突變菌株A10的菌體生物量顯著性高于出發菌株及其他突變菌株外，其余的菌株菌體生物量無較大差別，其中B5、B13這2株突變菌株略高于出發菌株。綜合菌落形態、庚基靈菌紅素產量和菌體生物量等因素，最終選擇B5、B13這2株突變菌株進行下一輪的遺傳穩定性復篩。

圖3 突變菌株的庚基靈菌紅素產量

**表示突變菌株A10菌體生物量顯著高于其他水平突變株

2.4 突變菌株的穩定性

突變菌株B5在傳代3代后菌株的庚基靈菌紅素產量開始下降(圖5a)，推測突變菌株B5的遺傳不穩定；而突變菌株B13的庚基靈菌紅素產量相對穩定在748.91—756.27 μg/mL，沒有隨著傳代數的增加而下降(圖5b)，所以最終確定突變菌株B13為最佳突變菌株。

圖5 B5和B13的遺傳穩定性

3 討論

海洋細菌Notoacmeibactersp.BGMRC2072代謝過程中主要累積庚基靈菌紅素，盡管生物合成途徑未明確，但課題組前期研究發現庚基靈菌紅素在對數生長期前期產量極低，培養16—32 h菌體進入穩定期后開始大量合成，并于接種后40 h達到最大值，約為(384.27±13.25) mg/L，且這類靈菌紅素對高溫、紫外線照射具有較強的抗性[18]，因此提高海洋細菌Notoacmeibactersp.BGMRC2072的庚基靈菌紅素生產能力具有重要的研究意義。利用ARTP誘變技術得到的突變菌株存在正突變和負突變，為了快速高效地篩選到有利的菌株，結合菌株生長形態和生物量(OD600)進行快速初篩。金瑋玥等[22]通過測定OD600并觀察菌株顏色深淺進行初篩，最終結合實驗篩選到一株高產類胡蘿卜素的菌株。Cao等[20]綜合考慮菌體密度、比生長速率、菌體干重、脂肪酸產率等最終獲得一株總脂肪酸含量明顯提高的突變株，該方法顯著提高ARTP誘變突變株的篩選效率。本研究通過觀察單菌落的形態及顏色，結合細菌生物量OD600進行初篩，得到35株突變株，再通過測定初篩菌株的庚基靈菌紅素的產量，獲得10株庚基靈菌紅素產量高于出發菌株產量20%的突變株，最后以生物量為指標篩選優勢突變菌。結果表明突變菌株的菌體生物量和庚基靈菌紅素產量均高于出發菌株，進一步證明通過菌體生物量、單菌落個體大小及菌體顏色深淺能夠提示菌株發生了正突變。

為了更好地發酵生產庚基靈菌紅素，下一步還需對突變菌株開展培養條件優化、發酵罐發酵培養等，并對突變菌株進行全基因測序分析，明確庚基靈菌紅素的生物合成分子調控機理，為實現庚基靈菌紅素的產業化生產奠定基礎。

4 結論

本實驗以海洋細菌Notoacmeibactersp.BGMRC2072為出發菌株，利用常壓室溫等離子體(ARTP)進行誘變，得到一株高產庚基靈菌紅素的突變菌株B13，其庚基靈菌紅素產量為748.91 μg/mL，而出發菌株為384.27 μg/mL，突變菌株B13比原始菌株的庚基靈菌紅素產量增加了94.9%，且突變菌株B13具有良好的遺傳穩定性。