海洋來源真菌的曲酸發酵條件優化*

梁芳萍，邢楠楠，劉永宏，高程海，張杰良，陳顯強**

(1.廣西中醫藥大學海洋藥物研究院，廣西南寧 530200；2.廣西中醫藥大學，廣西中醫藥科學實驗中心/廣西中醫基礎研究重點實驗室，廣西南寧 530200；3.汕頭大學理學院生物系，廣東汕頭 515063)

0 引言

曲酸(Kojic acid)又名麴酸、曲菌酸，具有抗氧化、抗菌、殺蟲、抗腫瘤等廣泛的生物活性，曲酸及其衍生物現已開發成為護膚霜、洗液、肥皂和牙科護理產品，廣泛應用于化妝品、食品和制藥工業等領域[1-3]。醫學方面，有研究表明曲酸有望成為治療人角膜內皮細胞衰老相關疾病的藥物[4]，以及治療和預防馬爾尼菲藍狀菌感染的重要輔助藥物[5,6]；另外，體內外實驗研究表明曲酸具有很強的抗弓形蟲活性[7]。在農業領域，曲酸可作為防治飛蝗的有機磷類殺蟲劑的增效劑[8]。在食品方面，曲酸可保鮮蔬菜，提高食品的保藏品質[9]。雖然一些研究發現曲酸具有一定的致癌作用[10]，但是在有效劑量濃度下曲酸的使用是安全的[1,3]。隨著研究的深入，曲酸的應用范圍將會繼續擴大。

生產曲酸的菌種多見于曲霉屬和青霉屬真菌，如Aspergillusoryzae、A.flavus、A.tamarii、Penicilliumcitrinum、P.griseofulvum、P.purpurogenum和P.rubrum等[11]。這些真菌的曲酸產量與其發酵工藝密切相關，發酵工藝的優化是提高曲酸產量的研究熱點。目前，曲酸發酵工藝的優化主要包括碳源、氮源、礦物質元素、促進劑等培養基成分優化和發酵條件優化[12,13]。在曲酸生產中，葡萄糖、蔗糖和淀粉通常用作碳源，蛋白胨和酵母膏則是常用的氮源。另外，部分農工副產品也可用作曲酸發酵的培養基成分，如豆渣、黃漿水、木薯淀粉、白薯粉淀粉酶水解液、柑橘皮渣、豆餅粉、鰹油等[14-16]。魏少鵬等[17]研究發現在蔗糖與葡萄糖組合作為碳源時，曲酸產量明顯高于單一碳源，蛋白胨與酵母提取物等有機氮比無機氮更有利于曲酸產量的提高。而低濃度的甲醇、乙醇、氯丙醇等作為添加劑也能夠提高曲酸產量[18]。

本研究從海洋沉積物中發現一株曲霉Aspergillussp.GXIMD02003，其能夠在大米培養基中產曲酸。為進一步提高該真菌的曲酸產量，本研究對海鹽含量和發酵時間對曲酸產量的影響進行實驗。曲酸生產在工業化生產和工藝研究中多采用液體培養基發酵，但其所需設備和原料成本較高，因此本研究使用大米固體培養基，旨在規避曲酸生產中添加原料復雜、成本高、生產過程煩瑣的問題，簡化生產過程，從而獲得成本低廉的曲酸原料。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

曲酸對照品，廣州分析測試中心科力技術開發公司生產；麥芽提取粉，廣東環凱微生物科技有限公司生產；海鹽，廣東省鹽業集團多品種鹽股份有限公司生產；大米，貴州鴻穗農業開發有限公司生產；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮分析級試劑，均購買于成都市科隆化學品有限公司；甲酸(分析純)和磷酸(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司生產；磷酸二氫鉀(分析純)，廣東光華科技股份有限公司生產；甲醇(色譜純)，上海星可高純溶劑有限公司生產。

種子培養基：稱取海鹽3 g、麥芽提取粉1.5 g于500 mL錐形瓶中，加入100 mL水和適量玻璃珠，搖勻，在121℃下高壓滅菌20 min，冷卻后備用。

大米固體培養基：稱取75 g大米放入500 mL錐形瓶中，加入75 mL一定濃度的海鹽水，搖勻，在121℃下高壓滅菌20 min，冷卻后備用。

1.2 儀器

LC-2030C 3D Plus型高效液相色譜儀(日本島津)，N-1300V-WB型小型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)，ZWYR-2102型恒溫培養振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)，HR1500-IIB2型生物安全柜(青島海爾生物醫療股份有限公司)，MLS-3781L-PC型高壓滅菌鍋(SANYO Techno Solutions Tottori Co,Ltd.)，SB-5200D型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 菌種

菌株分離于廣西潿洲島的海泥，經過ITS rDNA基因序列分析，鑒定該菌株為真菌Aspergillussp.，保藏于廣西中醫藥大學海洋藥物研究院，編號為GXIMD02003。

1.4 方法

1.4.1 種子液制備

在生物安全柜中將平板培養基的菌種接種于種子培養基中，在25℃、180 r/min下培養72 h作為種子液。

1.4.2 曲酸發酵條件考察

(1)最佳鹽度

配制鹽度分別為0、1%、2%、3%、5%、7%的海鹽水溶液，按1.1節方法制備大米固體培養基，分別接入種子液5 mL，25℃靜置發酵30 d，每個濃度取3份樣品測定曲酸含量，取平均值。

(2)最佳發酵時間

使用最佳鹽度制備的大米固體培養基，接入種子液5 mL進行發酵培養，分別在第15，20，25，30，35，40天取兩份樣品，檢測曲酸含量，計算平均值。

1.4.3 發酵條件驗證

在最佳鹽度和發酵時間條件下發酵，高效液相色譜法(HPLC)檢測曲酸含量，計算曲酸產量，從而驗證研究結果的可重現性。

1.4.4 曲酸的提取與檢測

(1)曲酸標準溶液配制

稱取曲酸對照品5 mg，精密稱量，超純水溶解后，轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻度線。配置成0.54 mg/mL曲酸標準儲備溶液。在使用時，用超純水稀釋至所需濃度，分別以質量濃度為8.44，16.88，33.75，67.5，135 mg/L的曲酸標準溶液進樣，記錄色譜圖。以色譜峰面積(Y)對樣品溶液的質量濃度(X，mg/L)繪制標準曲線，所得回歸方程為Y=24389.37X+2678.94，相關系數R=0.999 99 (R2=1)，結果說明在8.44-135 mg/L內線性關系良好。

(2)曲酸的提取

曲酸的提取方法基于文獻[19,20]并作適當調整。由于曲酸易溶于水，因此通常采用水作為曲酸的提取溶劑。為確定最佳的提取參數，本研究考察液料比和超聲提取次數對曲酸提取的影響。其提取方法簡述如下：將發酵后的大米培養基攪碎，稱取適量樣品，加入一定比例的蒸餾水超聲提取，過濾，合并過濾液;回收溶劑后得到樣品，加入超純水溶解，定容于10 mL容量瓶中備用。

(3)曲酸的高效液相色譜法檢測

曲酸檢測參照文獻[19,20]已報道的方法。色譜柱：Inertsil ODS-SP (5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：2‰磷酸水溶液(A)/甲醇(B)(95∶5) 等度洗脫；流速：1.2 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：269 nm；進樣體積：10 μL。

2 結果與分析

2.1 曲酸提取條件的確定

隨著提取溶劑體積的增加，大米培養基中曲酸的提取量均有不同程度提高。方差分析顯示，當液料比達到15∶1后，繼續增大液料比，曲酸提取率沒有顯著提高，即液料比15∶1和20∶1的提取結果無顯著性差異，因此選擇液料比為15∶1(圖1a)。另外，隨著超聲提取次數的增加，曲酸提取量有所增加，超聲提取1次、2次、3次所得的曲酸含量皆存在顯著性差異，超聲提取4次與超聲提取3次無顯著性差異(圖1b)。因此，3次為最佳提取次數。根據優化的結果，確定液料比15∶1，提取3次為曲酸的最佳提取方案。

圖1 提取條件的考察

2.2 鹽度對曲酸產量的影響

在0、1%、2%、3%、5%、7%鹽度下，每克大米產生的曲酸量分別是11.9，23.6，24.3，21.7，19.9，19.8 mg (圖2)。結果表明，隨鹽度的增加，曲酸產量增高，在2%海鹽的培養基中曲酸產量最高；當海鹽含量大于2%后，曲酸產量呈稍微下降趨勢。但總體而言，含有海鹽的大米培養基所產生的曲酸量高于不含海鹽的大米培養基。此外，海鹽含量影響Aspergillussp.代謝產物的復雜性，如圖3所示，不含海鹽和1%海鹽培養基發酵產物的化學成分復雜，非曲酸成分占比較高；而當鹽度達到2%時，代謝產物成分簡單，主要為曲酸。

圖2 不同鹽度條件下的曲酸產量

A-F：濃度依次為0、1%、2%、3%、5%、7%的海鹽培養基,G:曲酸對照品

2.3 發酵時間對曲酸產量的影響

在15,20,25,30,35,40 d時的曲酸產量分別為10.1,13.8,17.0,25.8,26.5,26.2 mg/g (圖4)。隨發酵時間增加，曲酸的產量越來越高，但30 d后曲酸的產量增幅不大。因此，曲酸的最佳發酵時間為30 d。

圖4 不同發酵時間的曲酸產量

2.4 最佳發酵條件下的曲酸產量

為進一步驗證最佳條件下的曲酸產量，采用2%海鹽的大米培養基發酵30 d，HPLC檢測曲酸含量，測得最佳發酵條件下1 000 g大米培養基發酵產生的曲酸含量為24.2 mg/g (圖5)。

圖5 最佳發酵條件下的發酵產物HPLC圖

3 討論

海鹽的主要成分是氯化鈉，氯化鈉對維持細胞的正常形態有重要的作用。當鹽度提高到一定濃度后，可能使菌體處于滲透壓相對較高的狀態而影響真菌的生長或刺激真菌自身代謝的酶活性，從而影響代謝產物的變化。與空白組相比，含海鹽大米培養基的曲酸產量均有明顯的增加。另外，海鹽的含量影響Aspergillussp.代謝產物的復雜性(圖3)，Ola等[21]使用不含鹽的大米培養基培養Aspergillussp.，其代謝產物中主要含曲酸，與本研究結果不一致，其原因可能是文獻的菌種Aspergillussp.是從植物中分離出，其生長條件不需要鹽來維持菌體滲透壓便可產生曲酸。

真菌的發酵過程可分為真菌生長階段與代謝產物積累階段。在發酵的前期階段，大米培養基養分充足，真菌處于生長繁殖時期，代謝產物積累相對較少，曲酸含量相對較低。隨著真菌大量繁殖，其代謝產物不斷積累，曲酸含量明顯增加，Aspergillussp.GXIMD02003的曲酸產量在發酵30 d達到最高，為1 000 g大米培養基發酵產生24.2 g曲酸。李天笑等[22]發明專利比較米曲霉(A.oryzaeATCC42129)、雜色曲霉菌(A.versicolorATCC28286)以及黃曲霉(A.flavus)、煙曲霉(A.fumigatus)、倫氏曲霉(A.lentulus)在不含鹽的大米固體培養基發酵的曲酸產量，A.versicolorATCC28286的產量最高，為1 000 g大米培養基發酵產6.2 g曲酸[22]。本研究采用含鹽大米固體培養基發酵Aspergillussp.GXIMD02003，所得曲酸產量高于其報道的雜色曲霉菌(A.versicolorATCC28286)和黃曲霉(A.flavus) 的曲酸產量，分別為3.9倍和22.9倍。

4 結論

曲酸在生活中被廣泛應用，市場需求不斷增加，如何提高曲酸產量備受學者們關注，而優化真菌發酵工藝是提高曲酸產量的一種重要方法。本研究發現海洋來源真菌Aspergillussp.GXIMD02003能夠產生曲酸，其在含2%海鹽的大米培養基發酵30 d時曲酸產量相對最高。該研究結果說明海洋來源真菌Aspergillussp.GXIMD02003可以作為曲酸的生產菌株，海鹽影響該菌株的曲酸代謝。此外，本研究所提供發酵工藝所需儀器設備簡單、生產成本低、操作簡單，利于工業化生產。