長白山二道白河區森林康養對人體免疫功能的影響

劉艷波 王煥琦 王洪俊 安麗萍 范春楠 包學英 賈曉靜 李潔 黃琴扉 張瑋尹 杜培革

摘要：為了探討森林康養對人體免疫功能的影響，篩選12名健康志愿者于2019年7月上旬在吉林省長白山二道白河區森林康養基地進行為期“3天2夜”的康養活動。康養前后，利用流式細胞儀檢測外周血CD56+ NK細胞和CD3+淋巴細胞的百分比，通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定血漿中顆粒酶、顆粒溶素和穿孔素的濃度。研究結果發現，長白山二道白河區夏季“3天2夜”的森林康養活動顯著提高了外周血CD3+淋巴細胞和CD56+NK細胞的百分比（P<0.05），同時血漿中穿孔素、顆粒酶和顆粒溶素的水平增加（P<0.05）。由此可見，森林康養活動在一定程度上可提高人體免疫功能。

關鍵詞：森林康養，NK細胞，淋巴細胞，免疫活性，長白山

DOI： 10.12169/zgcsly.2020.12.04.0004

Abstract：?To explore the effect of forest therapy in the summer on human immune function in Baihe District of Changbai Mountain， Jilin Province， the study screens and selects 12 healthy volunteers to have a three-day and two-night forest therapy there. The percentages of CD56+ NK cells and CD3+ lymphocytes in their peripheral blood are monitored using flow cytometry， and the concentrations of Grs， GNLY and perforin in plasma are tested using Elisa assay before and after forest therapy. The results show that compared with the pretest conditions， the forest therapy produces a significant increase in percentage of CD3+ lymphocytes and CD56+ NK cells （P<0.05）， and also an obvious increase in the perforin，GrA， GrB and GNLY levels in plasma. The results suggest that forest therapy activities can significantly increase human immune function to a certain extent.

Keywords： forest therapy， NK cell， lymphocyte， immunological activity， Changbai Mountain

森林康養是目前公認的緩解壓力的有效途徑之一[1]，相關學者通過研究發現：森林康養過程中自然殺傷細胞（Natural Killer Cell，NK）的數量和活性均增加[2-3];此外，森林康養還可緩解焦慮、憤怒等不良情緒。森林康養在日本和德國非常受歡迎，甚至作為藥物的一部分進入國家醫療保險領域。有研究證實森林康養具有提高機體免疫功能的效應，主要由細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）和NK細胞完成，因為這些細胞內均含有穿孔素（Perforin）、顆粒酶（Granzyme，Grs）和顆粒溶素（Granulysin，GNLY）[4]。當淋巴細胞識別靶細胞后，顆粒酶會迅速釋放到淋巴細胞—靶細胞突觸中，通過多種途徑誘導細胞死亡;穿孔素有助于顆粒酶進入靶細胞胞質發揮作用，該途徑是CTL誘導細胞死亡的主要機制;顆粒溶素對多種微生物和腫瘤具有廣泛的細胞溶解活性[5]。因此，NK和淋巴細胞數量的增加，穿孔素、顆粒酶和顆粒溶素釋放增多被視為增強免疫功能的關鍵指標。有學者已在日本進行了針對健康志愿者為期3天2夜的森林康養對免疫功能影響的研究，但由于地理位置不同、森林結構以及研究季節等諸多因素的差異，非常有必要進行對比研究。本文通過分析健康志愿者夏季在長白山二道白河區進行森林康養前后免疫功能相關指標的變化，明確森林康養能夠提高免疫功能的相關機理。

1 材料與方法

1.1 研究區概況及研究對象

本研究在吉林省長白山二道白河區著名的風景地長白山天池附近開展，康養區分為休閑娛樂區、森林本底區和棧道休憩區，二道白河區夏季林分豐富，覆蓋著大量的喬木和灌木，景色宜人，且森林步道完好，輔助設施完善。本次森林康養研究期間環境質量佳，適合康養活動[6]。

本研究從吉林市政府部門及當地大學篩選12名健康志愿者，其年齡介于50～60歲，平均年齡為（55.8±6.68）歲。所有志愿者均無心血管疾病、精神疾病史，3個月內未服用任何影響身心健康的藥物，近期沒有參加過森林康養或其他類似的旅行。所有志愿者在森林康養過程中三餐合理搭配，不可飲用含有酒精的飲料。該項研究符合北華大學醫學倫理學要求，康養前，所有的志愿者均親自簽署知情同意書并詳細填寫調查問卷[6-8]。

1.2 康養過程

志愿者于2019年7月上旬在長白山二道白河區進行了為期3天2夜康養之旅，為防止情緒波動對康養效果產生影響，志愿者在酒店內可以隨意活動，但要避免劇烈運動以及長時間瀏覽手機網頁、打電話或其他影響睡眠的刺激性活動。本研究的康養活動與日本學者李卿教授[4]設計的森林浴相似。主要過程為：第1天下午，志愿者在廣泛種植白樺、胡桃、松樹、柏樹和灌木的康養區漫步，時長為2 h;第2天，志愿者分別于上午和下午在林中步道各漫步2 h，森林漫步期間在棧道休憩區約進行1 h森林冥想，徹底放松;第3天一大早，志愿者抽取血樣并完成問卷調查后返回吉林市。除午餐時間外，所有志愿者9∶00—17∶00停留在森林康養區。第1天和第3天早8∶00前完成采取及調查問卷工作。

1.3 測定指標及方法

為驗證森林康養對免疫功能的影響，本研究分別于森林康養前后采集志愿者靜脈血樣，進行外周血CD56+ NK 細胞和CD3+ 淋巴細胞百分比檢測，以及血清GrA、GrB、perforin和GNLY分泌水平檢測。

1.3.1 主要試劑

本研究所用主要試劑有：抗CD3-FITC （ab34275）抗體和抗CD56-FITC （ab234250）抗體購自Abcam公司 （Cambridge， MA， USA）;人源性 GNLY Elisa kit（XL-Eh1850）試劑盒、人源性 Gra-A Elisa kit（XL-Eh1375）試劑盒、人源性Gra-B Elisa kit （XL-Eh1374）試劑盒購自美國Abcam公司（Cambridge， MA， USA）;其他均為國產分析純試劑。

1.3.2CD56+ NK細胞和CD3+淋巴細胞百分比檢測

抽取靜脈血，采用乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）進行抗凝，抗CD56-FITC抗體和抗CD3-FITC抗體與100 μL 全血混合，分別與特異性的靶細胞結合，紅細胞經氯化銨溶液處理后產生溶血，離心后，利用流式細胞儀檢測NK細胞和淋巴細胞的百分比。

1.3.3 酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA）

制備血漿于4 ℃冰箱內保存。利用生物素標記的雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測perforin、Grs和GNLY的水平。ELISA試驗的主要過程為：首先將血漿加入事先包被好的孔板內，37 ℃孵育2 h后，將生物素標記的perforin、GrA、GrB和GNLY 抗體加入孔板內，與辣根過氧化物酶標記的鏈親和素（streptavidin-HRP）形成復合物，孵育2 h后充分洗滌，除去未結合的酶;然后加入底物A和B以生成藍色產物，該產物在酸的作用下轉化為最終的黃色。顏色的深度與樣品中靶分子的濃度呈正比。

1.4 統計學分析

利用配對的t檢驗檢測康養前后相關指標的變化，使用Microsoft Excel software package作圖，以P<0.05作為差異具有顯著性的標準。

2 結果與分析

2.1 森林康養對外周血淋巴細胞及NK細胞百分比的影響

經過3天2夜的森林康養，志愿者外周血淋巴細胞的百分比明顯增加（P= 0.049），NK細胞的百分比亦明顯增加（P = 0.027）（圖1）。

2.2 森林康養對穿孔素、顆粒酶及顆粒溶素釋放的影響

NK細胞主要通過細胞毒顆粒的釋放以及受體介導的凋亡途徑誘導靶細胞死亡，一旦NK細胞接近欲殺死的靶細胞，perforin就從淋巴細胞釋放，在靶細胞的胞膜形成微小孔道，Grs以及其他的相關分子將通過微孔道進入靶細胞內，造成細胞的凋亡。3天2夜的森林康養可顯著提高志愿者血漿中perforin的水平（圖2）（P= 0.011） ，同時，血漿中GrA（圖2）和GrB（P=0.044）（圖3）的水平明顯增加。

GNLY可以借助其陽離子兩性結構裂解細菌膜，并具有對線粒體和溶酶體膜的透化作用，能夠殺死CTL或NK細胞靶向的其他細胞，是反映機體免疫功能的重要指標。本研究結果顯示：為期3天2夜的森林康養明顯增加CD56+ NK 細胞和CD3+ 淋巴細胞釋放GNLY（圖2）。

3 結論與討論

3.1 結論

本研究于盛夏7月在長白山二道白河區進行為期3天2夜的康養活動，對比分析了森林康養前后全血CD3+淋巴細胞和CD56+NK細胞百分比變化以及血漿perforin、GrA、GrB和GNLY水平差異。研究結果發現：為期3天2夜的康養活動明顯提高了CD3+淋巴細胞和CD56+NK細胞百分比，同時血漿中Perforin、GrA、GrB和GNLY的水平較康養前也明顯增加。研究結果證實了夏季在長白山地區進行森林康養可以明顯提高機體免疫功能，但具體機制尚需進一步探討，本研究還存在需改進之處，如增加不同年齡段志愿者人數、適當延長康養時間，進行春、秋、冬季康養效果比較等，條件允許可進行動物實驗，進一步探討森林康養提高機體免疫功能的機理等。

3.2 討論

本研究結果表明，森林康養后明顯提高了血液中CD3+淋巴細胞和CD56+NK細胞百分比，同時血漿中Perforin、GrA、GrB和GNLY的水平較康養前也明顯增加。說明森林康養可使免疫細胞短時間內進入外周血的數量增加，同時提高淋巴細胞和NK細胞的活性。這也可能是由于這些細胞在多種抗原（如芬多精）的刺激下被激活，它們通過顆粒胞吐途徑將細胞內perforin、Grs和GNLY釋放到細胞外，發揮相應的免疫功能。已有研究證實，如果將小鼠的perforin基因敲除，則NK細胞發揮細胞毒作用將大大降低[9-10]，說明NK細胞發揮細胞毒作用至少部分通過perforin起作用。前期研究已表明，森林康養可緩解健康及2型糖尿病人群的應激反應，使交感神經系統活性降低[6，8]，降低皮質醇分泌及大腦前額葉活動，但可增強副交感神經系統的活性，并使外周血中淋巴細胞增加[11-12]，這些淋巴細胞可釋放大量的perforin、GrA、GrB和GNLY進入血液循環，直接攻擊外來的異體細胞、體內突變的腫瘤細胞和病毒感染的細胞。其他研究還表明，一般情況下，Perforin和Grs均貯存在NK細胞、細胞毒T淋巴細胞及其他有核細胞的胞漿顆粒中，一旦這些細胞被激活，Perforin單體即可插入細胞膜，在鈣離子作用下，多個perforin聚合成內徑約16nm的通道，使Grs等多種毒蛋白迅速進入靶細胞。GrA既可直接激活Caspase，也可通過裂解IL-1發揮促凋亡效應;而GrB可直接降解Caspase底物、核基質抗原、核酶抑制劑催化亞基及核纖層蛋白而發揮抗腫瘤及抗微生物效應[13-14]。在殺傷異物的同時，Grs可通過正反饋途徑迅速合成更多的Grs[15]，發揮更強大的免疫效應。GNLY主要由細胞毒T淋巴細胞和NK細胞分泌，在機體免疫應答過程中，GNLY與perforin和Grs等顆粒成分一起排出胞外，參與抗菌、抗病毒、抗寄生蟲及殺傷腫瘤細胞等免疫過程[16]。因此，Perforin、GrA、GrB和GNLY的血漿水平在一定程度可以反應機體短時間內的免疫狀況。

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