臨潁縣辣椒大田病害調查及主要病害的病原鑒定

李小杰 邵欣欣 白靜科 李勝利 劉暢 李淑君 郭艷春

摘? ? 要：針對近年來臨潁縣辣椒病害日益嚴重、防治困難等問題，為明確病害發生種類，2020年6—9月對臨潁縣辣椒病害進行調查，采集具有典型癥狀的病害樣品進行病原鑒定。調查結果表明，臨潁縣辣椒病害有病毒病、根腐病、疫病、立枯病、根結線蟲病、早疫病、炭疽病和黑斑病等8種，其中，根莖部病害以根腐病為主，葉部病害以病毒病和早疫病為主，果實病害以炭疽病為主。對主要病害進行病原鑒定和致病性測定，將辣椒根腐病的病原鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），病毒病的毒原有煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV ）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY），早疫病的病原為鏈格孢菌（Alternaria alternata）。炭疽病的病原為喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii），是引起辣椒炭疽病的初次報道。試驗結果為辣椒病害的準確識別和精準防控提供了理論依據。

關鍵詞：辣椒;臨潁縣;病害調查;病原;致病性

中圖分類號：S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）12-010-06

Abstract： In view of the increasingly serious pepper diseases and difficult control in Linying county in recent years， the diseases of pepper in Linying county were investigated from June to September 2020， and the disease samples with typical symptoms were collected for pathogen identification. The results of the survey showed that there were 8 kinds of pepper diseases including viral diseases， Phytophthora blight， root rot， root-knot nematode， damping off ， early blight， anthracnose and black spot. Among them， root rot was the main disease in rhizome， viral diseases and early blight were the main diseases in leaf， and anthracnose was the main disease in fruit. The pathogen of pepper root rot was identified as Fusarium oxysporum. Viral diseases include Tobacco mosaic virus， Cucumber mosaic virus and Potato virus Y. The pathogen of early blight was identified as Alternaria alternata. It was the first report that pepper anthracnose was caused by Colletotrichum Karstii. This study provides theoretical basis for the identification and prevention of pepper diseases.

Key words： Pepper; Linying county; Disease investigation; Pathogen; Pathogenicity

辣椒（Capsicum annuum）屬茄科一年生草本植物，是我國重要的經濟作物，具有極高的營養價值和經濟價值。近年來，隨著辣椒種植結構的不斷變化以及受連作障礙和氣候條件等的影響，辣椒病害日趨嚴重且呈現復雜化[1-2]。目前，已報道的辣椒病害有10余種，其中苗期病害主要有病毒病、猝倒病、立枯病、灰霉病等，成株期病害主要有青枯病、疫病、枯萎病、炭疽病等[3-6]，嚴重影響辣椒的產量和品質。辣椒疫病、枯萎病和炭疽病是辣椒生產中發生普遍且危害較為嚴重的幾種病害，常造成巨大經濟損失[7-9]。

引起辣椒病害的病因、病原不同，防治方法也有所不同。同時，因為有些病害癥狀非常相似，很難用肉眼區分，給病害的精準防控帶來巨大困難。因此，準確識別田間病害種類，對病害的防控十分重要。河南省是我國朝天椒（俗稱小辣椒）種植面積最大的省份，臨潁縣又是全省重要的朝天椒基地，種植面積2.0萬hm2以上，年產干辣椒10萬t以上，是當地的主要經濟作物和重要經濟來源[10]。但隨著連作和種植年限的增加，辣椒病害日趨嚴重，尤其是盛花期及果實生長期遇到高溫多雨天氣，易造成病害發生與傳播，導致大面積落花落果，已成為制約朝天椒產量和品質提高的主要因素。筆者于2020年6—9月對臨潁縣朝天椒生產基地進行了病害調查，采集典型癥狀病害樣本進行病原鑒定，以期為臨潁縣及河南辣椒病害防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病害調查及樣本采集

2020年6—9月，分別于苗期、開花結果期對臨潁縣辣椒生產基地的辣椒病害進行調查，采集具有典型癥狀的病害樣本117份。其中，疑似病毒病樣本37份、根莖部樣本55份、葉部樣本9份、果實樣本16份（表1），分別裝于牛皮紙袋中，放入裝有冰袋的低溫保藏箱中立即帶回實驗室進行病原分離鑒定。

1.2 病原真菌的分離純化

采用組織分離法，切取病健交界處病組織，置于PDA培養基中，25 ℃恒溫培養2～3 d。待菌絲長出后，挑取目的菌絲放入新的PDA培養基中培養，即得純化菌株。觀察分離菌株的形態特征、菌絲及孢子形態。

1.3 病原真菌的分子鑒定

參照真菌基因組DNA柱式提取試劑盒說明書，提取分離菌株基因組DNA作為模板，應用真菌鑒定通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、β-微管蛋白基因引物TUB2-F（AACATGCGTGAGATTGTAAGT）和TUB2-R（ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC）進行PCR擴增。PCR反應體系（25 μL）：DNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，2×PCR Taq MasterMix 12.5 μL，雙蒸水補足到25 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min，30個循環;72 ℃ 10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將膠回收后委托生工生物有限公司進行測序。將獲得的各基因序列與GenBank中的序列進行比對分析，選擇同源性較高的序列用MEGA 7軟件中的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.4 病毒種類的分子鑒定

利用Trizol（Thermo Fisher Scientific）法提取不同辣椒病毒病樣本總RNA，具體方法參照說明書。按照反轉錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）說明書，將病毒RNA合成雙鏈cDNA作為模板，利用TMV、CMV、PVY和TEV特異性引物[11]進行PCR擴增。PCR反應體系同1.3。PCR反應條件為：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 變性40 s，51 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共30個循環;72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將膠回收后委托生工生物有限公司進行測序，并將序列在GenBank數據庫中進行Blast比對分析。

1.5 病原真菌的致病力測定

含菌麥粒接種法：將小麥清洗干凈煮至喝飽水未開花狀態，控水后稱取200 g裝入18×36×5絲規格的透明食用菌栽培袋中，用配套的套環封口，置于培養箱中28 ℃，70%濕度避光培養7 d，培養過程中每隔1 d搖晃食用菌栽培袋換氣。將直徑8.5 cm、高7 cm小花盆里裝入一半花盆的基質，每花盆放入10 g培養好的含菌種麥粒，再補放基質至花盆滿，移入辣椒苗，日常管理。10 d后觀察發病情況。

刺傷接種法：選擇健康的辣椒果實，用滅菌的針頭刺傷其表面，然后切取1 cm×1 cm的真菌菌絲塊貼于刺傷的果實表面，用脫脂棉蘸取無菌水保濕24 h，7 d后觀察發病情況。

2 結果與分析

2.1 臨潁縣辣椒病害發生概況

通過對臨潁縣4個主要辣椒種植區的病害調查發現，臨潁縣辣椒病害有病毒病、根腐病、疫病、立枯病、根結線蟲病、早疫病、炭疽病和黑斑病等8種（表2）。其中，辣椒病毒病發生較普遍，從苗期到成熟期均可發病，在生長前期危害嚴重，主要表現為植株矮化，葉片花葉、黃化、畸形等癥狀;辣椒根莖類病害主要有根腐病、疫病、立枯病和根結線蟲病，其中，以根腐病發生較為嚴重，主要表現為植株矮小，葉片黃化萎蔫，根部變褐;辣椒葉果類病害主要是早疫病和炭疽病，在辣椒生長的各個時期均有發生，其中，以果實炭疽病發生較為普遍且危害嚴重。辣椒黑斑病零星發生，且多發生在日灼處。

2.2 辣椒主要病害的田間癥狀及病原鑒定

2.2.1 辣椒病毒病 辣椒病毒病的田間癥狀表現主要有花葉型：典型癥狀主要表現為病葉、病果出現不規則褪綠，呈現黃綠相間的斑駁，輕癥植株生長正常，嚴重時植株生長緩慢或矮化（圖1-a）;畸形：主要表現為葉面皺縮，葉緣向上卷曲，嚴重時葉片變成線狀，后期植株上部節間短縮，呈叢簇狀（圖1-b）。對采集的37個疑似病毒病樣本進行PCR擴增，其中，28份樣本中同時擴增出TMV和CMV兩種病毒的特異條帶，6份樣本中同時擴增出TMV、CMV和PVY三種病毒的特異條帶（圖1-c），1份樣本中只檢測到TMV的特異條帶，2份樣本中只檢測到CMV的特異條帶，各樣本均未擴增出TEV病毒的特異條帶。由此表明，臨潁縣辣椒病毒病的毒原主要有煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY），且復合侵染率達到90%以上。

2.2.2 辣椒根腐病 辣椒根腐病的田間發病癥狀主要表現為病株地上部枝葉變黃萎蔫，拔出后發現根系變褐腐爛（圖2-a），表皮易脫落。其中，樣本編號為LJ-53的分離菌株在PDA培養基上，菌落為白色，菌絲茂密，呈疏松棉絮狀（圖2-b）。大型分生孢子鐮刀形，無色，具3～5個隔膜;小型分生孢子卵形至腎形，單胞或雙胞，無色（圖2-c）。利用含菌麥粒接種法對菌株LJ-53進行回接，發病癥狀與田間癥狀相似（圖2-d）。

分子鑒定結果表明，LJ-53分離菌株與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）序列最大相似率為99.85%，且與Fusarium oxysporum Fo5176位于同一進化分支（圖3）。

2.2.3 辣椒早疫病 辣椒早疫病的發病葉片上病斑呈圓形，黑褐色，有同心輪紋，潮濕時有黑色霉層（圖4-a）。其中，從樣本編號為LJ-60的病葉上分離的菌株在PDA培養基上，菌落呈圓形絨毛狀，正面為灰色或灰黑色，背面為黑色（圖4-b～c）。菌絲具隔，暗黑色，分生孢子磚隔或多隔，錐形（圖4-d～f）。依據菌落和分生孢子特征，初步鑒定為鏈格孢菌（Alternaria）。

分子鑒定結果表明（圖5），LJ-60分離菌株與鏈格孢菌（Alternaria alternata）序列最大相似率達99.92%，且與Alternaria alternata G408位于同一進化分支。

2.2.4 辣椒炭疽病 辣椒炭疽病可危害葉片、莖和果實。生長后期主要危害果實，且以成熟果受害較重。發病果實上呈圓形或不規則形病斑、稍凹陷，斑上生黑色小點，干燥時病斑常干縮似羊皮紙（圖6-a）。其中，從樣本編號為LJ-65的病果上分離的菌株在PDA培養基上，菌絲生長密實，正面初呈白色或黃色，有稍隆起的同心輪紋，上面著生小黑點，后期溢出淡紅色黏狀物（圖6-b～c）。分生孢子盤無剛毛，分生孢子長橢圓形，無色，單胞（圖6-d～f）。分子鑒定結果表明，LJ-65分離菌株與喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）的同源性高達99.17%，且位于同一進化分支（圖7～8）。利用刺傷接種法對LJ-65菌株進行回接驗證，辣椒果實接種部位出現圓形凹陷病斑（圖6-g），表明該菌株具有致病性，為辣椒炭疽病的病原。

3 討論與結論

本研究調查結果表明，臨潁縣辣椒病害主要有病毒病、早疫病、根腐病、炭疽病、疫病及根結線蟲病等。其中，病毒病在辣椒生長前期危害較重，且毒原種類復雜，復合侵染率較高，這與前人研究結果基本一致[12]，但本試驗中只用了TMV、CMV、PVY和TEV四種病毒的特異引物進行了毒原種類檢測，后期將增加分子檢測的病毒種類。辣椒根腐病為辣椒常見的土傳病害，在全國各地普遍發生，嚴重影響辣椒的產量和品質。引起辣椒根腐病的病原菌有尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、腐皮或茄病鐮孢菌（Fusarium solani）、木賊鐮孢菌（Fusarium equiseti）和串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme）等，其中，以腐皮或茄病鐮孢菌（Fusarium solani）為主[13-14]。筆者從臨潁縣發病辣椒根部分離出大量鐮刀菌，且多數菌株具有較強的致病性，經鑒定均為尖孢鐮刀菌，與前人報道有所不同，這可能與地域或品種差異有關。

目前，已報道的辣椒炭疽病的病原菌有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporoides）、黑色炭疽菌（Colletotrichum nigrum）、黑點炭疽菌（Colletotrichum capsici）、尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）和喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）等15種左右，其中，以膠孢炭疽菌（C. gloeosporoides）和黑點炭疽菌（C. capsici）侵染較為普遍[15-17]。目前，國內外對其他植物炭疽病的病原菌C. karstii已有相關研究報道[18-20]，但未見在辣椒上的相關報道。筆者從臨潁縣發病辣椒果實上分離出的炭疽菌經鑒定為喀斯特炭疽菌（C. karstii），這是引起辣椒炭疽病的初次報道，是否還有其他炭疽菌種類，還需擴大取樣范圍和數量，進一步明確辣椒炭疽病的致病菌，并對其生物學特性及致病機制進行初步研究，為辣椒炭疽病的準確識別和防控提供理論依據。另外，在某些發病辣椒果實上能同時分離出炭疽菌和鏈格孢菌，且個別鏈格孢菌具有弱致病性，說明辣椒炭疽病和黑斑病可能混合發生，也有可能是炭疽菌侵染辣椒果實形成壞死病斑后造成鏈格孢菌腐生的結果。

筆者明確了臨潁縣辣椒病害主要有病毒病、根腐病、早疫病和炭疽病等，其中，病毒病的主要毒原有TMV、CMV和PVY，且復合侵染率較高;由尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）侵染引起的根腐病為辣椒的主要根莖部病害;由鏈格孢菌（A. alternata）引起的辣椒早疫病和炭疽菌（Colletotrichum sp.）引起的辣椒炭疽病是主要的葉果類病害，并初次報道了喀斯特炭疽菌（C. karstii）可引起辣椒炭疽病。本次試驗結果為臨潁縣辣椒病害的準確識別提供了參考，對病害的精準防控具有指導意義。

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