羊角脆甜瓜果皮細胞形態及色素分布顯微觀察

王佳豪 乜蘭春 趙文圣 葛暢 段雅倩

摘? ? 要：羊角脆甜瓜為青縣地理標志性產品，但其果面常出現瘤狀凸起及綠色、黃色或黃綠色斑塊現象，影響果實外觀品質。為了解其果皮組織結構、細胞形態及色素分布，利用徒手切片和石蠟切片技術對不同發育階段果實的果皮進行了顯微觀察。結果表明，授粉至授粉后5 d外果皮細胞呈矩形且排列緊密，中果皮為排列無規則的圓形細胞，授粉5～15 d外果皮和中果皮細胞迅速增大，形狀和排列發生明顯改變，授粉15 d至果實成熟，外果皮和中果皮細胞形狀和排列不再發生明顯改變。瘤狀凸起果實自外表皮30層以下的細胞長軸極顯著高于正常果實，且部分橢圓細胞長軸走向變為垂直于表皮切線，大量此類細胞在局部積聚造成果實表面異常瘤狀凸起。正常成熟果實自外果皮10層以下的薄壁細胞存在葉綠素，而10層以內細胞無色素，果皮呈灰白色;果皮上的綠斑是因為外果皮10層以內細胞出現了葉綠素;黃斑則是因為外果皮細胞間出現了黃色色素物質;兩種情況發生在同一區域時，果皮出現黃綠色斑塊。

關鍵詞：羊角脆甜瓜;果皮;色素分布;細胞形態

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）12-096-05

Abstract： Yangjiaocui melon is the leading melon variety cultivated in Qingxian County. The commodity quality of the fruit was often affected by the appearance of tumours like bulges， green， yellow or yellow-green colour spots on the surface of the fruit. To study the cell morphology and pigment distribution of fruit peel， freehand section and paraffin section techniques were performed at different developmental stages. The results showed that the exocarp cells were rectangular and closely arranged， while the mesocarp cells were rounded and irregularly arranged from 0 to 5 days after pollination. The exocarp and mesocarp cells grew rapidly and significantly changed shapes and arrangement during 5-15 days after pollination. From 15 days after pollination to fruit ripening， there were no significant changes in exocarp and mesocarp cells shapes and arrangement was observed. The long axis of cells in the tumour-like bulges fruit from the outer epidermis below 30 layers was significantly higher than that in the normal fruit， and the long axis of some cells became perpendicular to the epidermal tangents， a large number of such cells locally accumulated can cause the problem of tumor-like bulges. In mature fruits， chlorophyll usually existed in parenchymatous cells below 10 layers of exocarp， and there was no pigment within 10 layers’ cells. Therefore， the fruit peel was an off white colour. The green spots on fruit peel were due to the appearance of chlorophyll in the cells within 10 layers of the exocarp， and the yellow spots resulted from the presence of yellow pigment among intercellular space in exocarp cells. When both of two above mentioned cases occurred at the same area， the yellow-green patches appeared in fruit peel.

Key words： Yangjiaocui melons; Pericarp; Pigment distribution; Cell morphology

甜瓜在我國栽培歷史悠久，種植廣泛，截止到目前我國已連續30余年成為世界上甜瓜種植面積最大、產量和栽培品種最多的大國[1-2]，羊角脆屬薄皮甜瓜，青縣羊角脆為國家地理標志產品、河北省特色優勢農產品，在河北滄州青縣已有千年以上的栽培歷史。目前，在青縣及周邊縣市種植面積近7000 hm2[3]。羊角脆甜瓜果實形似羊角，甜脆爽口，是夏季消暑的佳品，深受消費者喜愛[4]。其成熟果實為灰白色，但實際生產中，果面常有綠色、黃色或黃綠色斑塊，還有一些果實果面出現瘤狀凸起，嚴重影響果實外觀品質，了解果皮細胞形態以及色素分布對解決以上問題具有重要意義。前人對厚皮甜瓜、西瓜果皮組織結構做過一些研究，吳貝等[5]觀察京蜜11薄皮甜瓜授粉后0～5 d的幼果中果肉細胞變化，指出開花后3 d可能是其快速膨大的啟動時期，授粉后5 d細胞明顯增大且排列緊密。梁世才等[6]在對厚皮甜瓜的研究中指出，M01-3厚皮甜瓜自授粉至果實軟化成熟的過程中經歷了一個細胞迅速生長分裂到生長速度減慢的過程，果實成熟時外果皮細胞間填充大量的木質素成分，中果皮細胞高度分散，細胞相互融合。高美玲等[7]通過觀察薄皮和厚皮西瓜外果皮的石蠟切片，總結出薄、厚皮西瓜外果皮細胞生長方向分別為縱向生長和橫向生長，厚皮西瓜外果皮石細胞團較大且細胞較大。羊角脆甜瓜在薄皮甜瓜中外觀顏色、形狀及口感均獨具特色，而其果皮發生的斑塊及瘤狀凸起嚴重影響經濟品質，從而導致銷量的降低，果實宏觀表現與其微觀結構密不可分，針對其果皮進行的顯微觀察意義重大，而目前未見對羊角脆薄皮甜瓜細胞形態及色素分布的研究報道。筆者對羊角脆甜瓜果實發育過程中果皮細胞形態和色素分布進行了顯微觀察，以期了解羊角脆甜瓜果皮發育過程、瘤狀凸起及色斑成因，為改善果實外觀品質奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試材為青縣蔬菜技術服務中心提供的地方品種青縣羊角脆。

1.2 方法

試驗時間為2019年1—7月，其中育苗、種植及取樣部分在青縣司馬莊綠豪農業專業合作社日光溫室內進行。切片制作及顯微觀察部分在河北農業大學園藝學院園藝植物栽培生理實驗室進行。于2019年1月14日使用50孔穴盤育苗，2019年2月20日定植，總試驗面積1000 m2，株距35 cm，行距90 cm，生長期間吊蔓栽培，單蔓整枝，在主蔓12～15節留果。4月7日對盛花果實進行授粉，授粉當天第1次取樣，至5月7日（果實商品成熟）每5 d取樣1次，共7次，每次取發育正常果實10個，切取樣品近果臍1/3處外果皮及其以內的0.5 cm中果皮制作石蠟切片，觀察自外果皮20層以內細胞的形態變化;商品成熟期取正常和果面瘤狀凸起的果實各10個，分別取正常部位和凸起部位果皮制作石蠟切片，觀察自外果皮以下30～60層細胞形態，測量細胞長軸及短軸的長度;取灰白色正常果實和分別帶有黃色、綠色、黃綠色斑塊的果實各10個，分別切對應部位的單層外果皮（表面）、外果皮及其以內0.5 cm中果皮（剖面），制作徒手切片，進行果皮色素分布顯微觀察。

徒手切片制作與觀察：用雙面刀片切取灰白色、黃色、綠色的果實外表皮，立即置于載玻片上，滴少許蒸餾水，壓蓋玻片，排凈空氣，使用OLYMPUS CX41RF生物顯微鏡觀察。

石蠟切片制作與觀察：在近果臍1/3處使用雙面刀片橫切果實，取外表皮及其以內的0.5 cm果皮，立即放入3.7%FAA固定液（V乙醇?V去離子水?V甲醛?V冰醋酸=10?7?2?1）中，真空泵抽真空20 min后置于梯度瓶中，60 r·min-1搖床上4 ℃固定過夜;依次使用50%、70%、85%、95%、100%乙醇脫水90 min，每個梯度加8滴2%曙紅染色（1 g曙紅粉末溶至50 mL乙醇），最后再次更換100%乙醇后不加染液4 ℃過夜;次日移至室溫，于60 r·min-1搖床上使用V乙醇?V脫蠟劑（Histoclear）為0?1、1?1、1?0（3次）依次滲透1 h，最后更換100% Histoclear，樣品上覆小塊石蠟，V石蠟?VHistoclear約1?4;次日將梯度瓶置于42 ℃恒溫箱，12 h后更換100%液態石蠟，置于60 ℃過夜;60 ℃環境下每隔24 h更換100%液態石蠟，連續更換4次，最后一次更換后5 h包埋，待蠟液完全凝固，置于4 ℃避光保存。使用組織切片刀將包含樣品的蠟塊切成梯狀體固定于組織包埋盒，SLEE CUT 4062-手動旋轉式石蠟切片機切7 μm薄片，37 ℃恒溫水浴鍋內攤片30 min，42 ℃烤片機烤片12 h，Histoclear脫蠟3次，每次10 min，OLYMPUS IX73倒置顯微鏡觀察。

細胞截面長軸及短軸測量：取瘤狀凸起果實和對照果實果皮縱切的石蠟切片各5片，拍照后在每片切片上隨機選取10個細胞，使用ToupView軟件測量其長軸和短軸長度。

2 結果與分析

2.1 不同發育階段果實的果皮結構與細胞形態

由圖1-A～G可以看出，羊角脆果實授粉當天和授粉后5、10、15、20、25、30 d（商品成熟）的果皮細胞形態。圖1-A中果實最外層細胞為外果皮，外果皮以內為中果皮，中果皮又分為上中果皮和下中果皮，果實授粉當天外果皮細胞排列緊密，形狀為矩形，細胞大小有差異，外果皮不平滑，上中果皮由4～6層等徑圓形細胞組成，下中果皮細胞體積較大，同樣為等徑圓形細胞組成。授粉后5 d（圖1-B）外果皮及中果皮細胞體積均有增大，細胞密度變小。至授粉后10 d（圖1-C）細胞繼續增大，外果皮細胞形狀更加規則，由此外果皮變得平展光滑，上中果皮細胞繼續增大，形狀開始向橢圓形轉變，下中果皮細胞排列緊密，形狀變為橢圓形。至授粉后15 d（圖1-D），外果皮細胞在垂直于表皮切線方向有明顯增長，排列規則且緊密，中果皮細胞全部為橢圓形。至授粉30 d（圖1-E～G），所觀察的外果皮及中果皮細胞不再發生明顯變化。另外，一部分羊角脆果實在發育中后期果皮會呈現瘤狀凸起狀態，造成果實表面凹凸不平，從而導致商品價值降低，圖1-H為商品成熟的瘤狀凸起果實果皮形態，在觀察視野下凸起部位果皮的細胞形態、大小及細胞排列與正常果實無明顯區別，而在若干層細胞下果皮細胞是否有差異還未可知。

2.2 瘤狀凸起果皮細胞形態

圖2為對照果實和瘤狀凸起果實凸起部位外果皮以下30～60層細胞顯微結構（取樣部位為圓圈所示），對照果實（圖2-A）細胞多為圓形至橢圓形，橢圓形細胞長軸方向多平行于表皮切線方向，其長軸長度均值為（71.90±14.16） μm，短軸長度均值為（41.93±8.97） μm。瘤狀凸起果實凸起部位（圖2-B）的細胞多數呈橢圓形，并且長軸方向多垂直于表皮切線方向，其長軸長度均值為（91.85±11.94） μm，極顯著高于正常果實，短軸長度均值為（42.81±7.20） μm，與正常果實差異不顯著，大量長軸垂直于表皮切線的細胞在局部積聚，導致果腔至外表皮距離增大，因此造成果皮瘤狀凸起現象。

2.3 不同顏色果皮的色素分布

灰白色（GW）果皮及黃色（Y）、綠色（G）、黃綠色（YG）斑塊果皮的色素分布情況見圖3，果皮取樣部位為圓圈所示。由圖3可以看出，甜瓜果皮由外到內分別為外果皮細胞和若干層薄壁細胞，其中灰白色正常果實的外果皮不存在色素物質，在約10層以下的薄壁細胞內才有葉綠體（GW1～GW2）;黃斑果皮的外果皮細胞間隙存在黃色色素物質（Y1～Y2）;綠斑果皮在外表皮細胞下10層以內的薄壁細胞中含有葉綠體（G1～G2）;黃綠色斑塊果皮的外表皮細胞間隙存在黃色物質，外表皮細胞下的10層薄壁細胞內存在葉綠體（YG1～YG2）。

3 討論與結論

果實外觀表現與果肉細胞形狀、排列密不可分，有研究表明果皮厚度與果皮細胞層數和果皮射線方向細胞直徑有直接關系[8-9]，微觀結構的變化可能由于基因突變、授粉不良和生長環境所引起[10-12]。前人在對馬家柚粗果皮的研究中指出，粗果皮形成主要是由于表皮油胞體積變大且有凸起導致，而粗皮果果皮增厚由于果皮射線方向細胞直徑更大，細胞間隙大引起[13]。損傷對果皮結構影響大，在對臍橙的研究中指出，輕微機械損傷后果皮經一系列復雜過程最終導致臍橙油胞破裂，宏觀表現為果實表面有許多小坑，嚴重影響其外觀品質[14]。生產中發現羊角脆甜瓜時有發生瘤狀凸起的問題，而當前針對該現象的研究未見報道，本試驗表明引起羊角脆果皮瘤狀凸起的原因主要是大量長軸垂直于表皮切線的細胞在局部積聚，導致果腔至外果皮的距離增大，從而引起瘤狀凸起現象。本試驗僅明確了瘤狀凸起果實的細胞形狀及排列，但該現象具體發生條件以及改善措施還需進一步研究。

果實顏色是評價外觀品質的重要指標，而色素種類、分布及含量直接決定了果實顏色[15]。黎明等[16]指出在黃肉桃花后65 d，外果皮下第4～12層果肉細胞分布大量葉綠體，數量由外向內逐漸減少，隨發育葉綠體數量下降、體積縮小，至果實成熟，葉綠體完全轉化為有色體。對于櫻桃番茄，在其果實綠熟期葉綠素含量極高，外觀表現為通體綠色，經過轉色期到成熟期果實葉綠素逐漸降低至較低水平，而胡蘿卜素和番茄紅素逐漸增加，到果實成熟番茄紅素占據總色素含量的90%以上，此時果實表現通體紅色[17]。Huang等[18]在對砂梨的研究中指出，果實遮光對果皮花青素含量有顯著影響，完全暴露于陽光下2～3周的果實可合成大量花青素，這表明光照對花青素的合成至關重要。羊角脆甜瓜成熟果實果皮顏色獨特，為通體灰白色，目前關于羊角脆甜瓜果實顏色的研究未見報道，本試驗結果表明正常的羊角脆商品成熟果實中有色物質為葉綠素，并且葉綠素出現在約10層以下的薄壁細胞內，果實外觀顯現灰白色。另外，葉綠體出現在10層以內的薄壁細胞中使外果皮顯現綠色斑塊;外表皮細胞間隙出現黃色色素物質使外果皮顯現黃色斑塊;外表皮出現黃色色素物質的同時外表皮下10層薄壁細胞內出現葉綠體而使果皮顯現黃綠色斑塊。本試驗初步闡明了羊角脆甜瓜的色素分布，但色素的發生條件以及控制顏色發生的技術措施還需進一步研究。

羊角脆甜瓜外果皮由單層矩形細胞組成，緊密排列在果實最外層，細胞長軸的走向垂直于表皮切線，中果皮細胞在發育過程中層數逐漸增多，形狀由圓形變為橢圓形，細胞的長軸走向平行于表皮切線;果實自授粉0～15 d細胞增大迅速，15 d后至成熟細胞形狀和排列不再發生明顯改變;果實異常瘤狀凸起是由于外表皮30層以下的細胞長軸增長，且部分橢圓形細胞長軸走向變為垂直于表皮切線造成;羊角脆正常成熟果實自外果皮10層以下的薄壁細胞存在葉綠素，而10層以內細胞無色素，果皮呈灰白色;果皮上的綠斑是因為外果皮10層以內細胞出現了葉綠素;黃斑則是因為外果皮細胞間出現了黃色色素物質;兩種情況發生在同一區域時，果皮出現黃綠色斑塊。

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