白藜蘆醇脂質體的制備及體外消化研究

范超中，莊滿意，溫 浩，李晨晨，普一涵，呂亞莉，李 靜

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

白藜蘆醇（Resveratrol，RES） 又名芪三酚，是一類主要存在于葡萄、虎杖、藜蘆和花生等植物中的含有芪類結構的非黃酮二苯乙烯多酚類化合物[1]，作為一種天然的食品活性成分，是一類具有極大價值及潛力的抗氧化類藥物[2]，被美國《抗衰老圣典》列為100 種最有效的抗衰老物質之一，在食品、營養補充品、化妝品、醫藥等行業有著廣闊的應用前景。但其水溶性較低（僅2.68 mg/L）、穩定性較差、遇熱見光易誘導轉換、半衰期短（8～14 min）、代謝和排泄過于迅速[3-4]、生物利用度低等缺點嚴重影響了生理活性的發揮。因此，探究提高白藜蘆醇的水溶性，促進其吸收并提高其生物利用度的方法，是目前食品營養領域研究的熱點和難題。

作為一種被廣泛研究的遞藥載體，脂質體具有無毒、兩親和生物可降解性等特征，可有效包裹維生素、礦物質、蛋白質、抗氧化劑等各類生物分子[5]。利用脂質體對白藜蘆醇進行包裹構建遞藥體系，可以有效地解決白藜蘆醇自身的穩定性問題，提高其在體內傳遞有效成分的效率及吸收利用率[2，6]。然而，脂質體成膜材料含有不飽和脂肪酸鏈的磷脂，容易導致膜結構穩定性差，易于融合形成大顆粒，從而引起藥物滲漏，在某種程度上限制了其在臨床上的應用。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） 是迄今為止已知蛋白和細胞吸收水平最低的親水聚合物[7]，因其無毒性和良好的生物相容性，廣泛應用于醫藥、食品等領域。目前，白藜蘆醇脂質體在體外消化的研究并不多見，探究白藜蘆醇脂質體在模擬胃腸道消化時的釋藥特征頗有必要。因此，采用低成本、操作簡便的薄膜超聲法設計單因素優化試驗制備白藜蘆醇脂質體，利用PEG-2000 對其修飾，采用紅外光譜分析脂質體的結構，建立胃腸道連續消化體系，開展體外模擬消化研究。對提高白藜蘆醇生物利用度具有潛在的理論價值和應用前景，也為拓展以脂質體為載體所建立的遞藥體系在食品藥品領域中的應用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇、大豆卵磷脂、膽固醇、胃蛋白酶、胰蛋白酶，均為生物純，索萊寶生物科技有限公司提供；PEG-2000（分析純），天津大茂化學試劑廠提供；三氯甲烷（分析純），天津市國藥集團提供；聚乙烯醇（PVA），Mw13000-23000，87%～89%水解度，Sigma-Aldrich；氯化鈉（分析純），天津市光復科技發展有限公司提供；磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、甲醇、無水乙醇、磷酸氫二鉀、鹽酸，均為分析純，天津市化學試劑一廠提供。

1.2 儀器與設備

WE-Z 型水浴恒溫振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司產品；DK-8D 型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司產品；TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司產品；DHG 型電熱鼓風干燥箱，天津市歐諾儀器儀表有限公司產品；Vector22 型傅立葉變換紅外光譜儀，德國布魯克光譜儀公司產品；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；FG2 型便攜式pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司產品；KQ-500DE 型數控超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司產品；RS-52AA 型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品；ALPHA 1-2 型CHRIST 冷凍干燥機，北京五洲東方科技發展有限公司產品；HJ-6型磁力攪拌電熱套，北京中興偉業儀器有限公司產品。

1.3 白藜蘆醇脂質體的制備

采用薄膜超聲法制備白藜蘆醇脂質體。準確稱取大豆卵磷脂、膽固醇和RES，加入30 mL 1∶1 混合的甲醇與三氯甲烷，溶解攪拌90 min 后，于40 ℃下旋轉蒸發，形成均勻的暗黃色薄膜，加入20 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4） 洗膜，攪拌40 min，于20～25 ℃下水浴超聲20 min，得到白藜蘆醇脂質體（RES-L）；加入20 mL PEG-2000 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4） 洗膜，按上述方法操作，得到修飾的白藜蘆醇脂質體（PEG-RES-L）。

1.4 包封率的測定

（1） 配置空白溶媒。吸取體積分數95%乙醇6 mL，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4） 定容至10 mL。

（2） 將制備好的RES-L 或PEG-RES-L 移入10 mL離心管中，以轉速10 000 r/min 離心30 min，吸取200 μL 上清液后加入95%乙醇6 mL，再以磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4） 定容至10 mL，于波長306 nm處測定吸光度，計算游離的白藜蘆醇量（A1）。

（3） 取RES-L 或PEG-RES-L 原液200 μL 加入95%乙醇6 mL，再以磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4）定容至10 mL，于波長306 nm 處測定吸光度，可得包封與未包封的白藜蘆醇總量（A2）。

根據下列計算公式，得到樣品中白藜蘆醇的包封率[8]：

式中：EE——包封率，%；

A1——游離的白藜蘆醇量，mg；

A2——包封與未包封的白藜蘆醇總量，mg。

1.5 白藜蘆醇脂質體的制備工藝優化

（1） 大豆卵磷脂與膽固醇的質量比。按照大豆卵磷脂∶膽固醇= 2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1測定脂質體的包封率，確定大豆卵磷脂與膽固醇的最佳質量比。

（2） 卵磷脂與白藜蘆醇的質量比。按照大豆卵磷脂∶RES = 10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1測定包封率，確定卵磷脂和白藜蘆醇的最佳質量比。

（3） PEG-2000 質量濃度的影響。配制0.25，0.50，1.00，1.50 mg/mL PEG-2000 的磷酸鹽緩沖溶液，測定脂質體的包封率，確定最佳的PEG-2000 質量濃度。

包封率最高的PEG-RES-L 做凍干處理，備用。

1.6 紅外光譜（FTIR） 分析

分別取干燥的PEG-2000，RES，PEG-RES-L 凍干粉末1 mg 與溴化鉀150 mg，研磨混勻，70 MPa下壓透明薄片，測定400～4 000 cm-1的紅外光譜。

1.7 體外消化試驗

按照《中華人民共和國藥典》2010 版二部附錄所述的溶出度測定方法，對透析袋（截留相對分子質量為8 000～12 000） 沸水煮10 min，再用蒸餾水進行清洗，再泡于蒸餾水中備用。配置體外消化試驗所用到的模擬胃液（Simulated gastric fluid，SGF）及模擬小腸液（Simulated intestinal fluid，SIF），37℃下備用，模擬白藜蘆醇脂質體在體內胃腸道連續消化的情況。

SGF 配方：配置500 mL SGF 需加入1.0 g NaCl固體粉末1.6 g 胃蛋白酶（Pepsin），使用去離子水作為溶劑，用濃度為0.1 mol/L 的鹽酸溶液調pH 值至1.2±0.1。

SIF 配方：配置500 mL SIF 需加入3.4 g 磷酸氫二鉀和1.6 g 胰蛋白酶（Trypsin），使用去離子水作為溶劑，用濃度為0.2 mol/L 的NaOH 溶液調pH 值至7.5±0.1。

以模擬胃液及模擬腸液為釋放介質，分別精密稱取最佳包封率下0.2 g 制備好的PEG-RES-L 冷凍干燥粉末和148 mg RES 原料（RES 的量由制備好的PEG-RES-L 的最優包封率換算得來），移入經上述方法處理過的透析袋中，并向其中加入SGF 10 mL，置于含有50 mL SGF 的帶塞錐形瓶中，再放入WE-Z 型水浴恒溫振蕩器，于37 ℃條件下，以轉速100 r/min 實時取樣2 mL，同時補加等體積的新鮮釋放介質，120 min 后向透析袋（截留相對分子質量為8 000～12 000） 中加入SIF 10 mL 繼續反應，同時釋放液中補充50 mL SIF，取樣。于波長306 nm 處測定吸光度，計算消化率。采用相同的方法測定白藜蘆醇及未經修飾的白藜蘆醇脂質體的消化行為，比較RES，RES-L 和PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道連續消化時的情況。

1.8 白藜蘆醇脂質體的穩定性試驗

將等量RES-L 和PEG-RES-L 于4 ℃下避光保存，分別在第2，4，6 天進行包封率測定，分析其穩定性。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇脂質體的制備工藝優化

2.1.1 大豆卵磷脂與膽固醇質量比

大豆卵磷脂與膽固醇質量比對白藜蘆醇脂質體包封率的影響見表1。

表1 大豆卵磷脂與膽固醇質量比對白藜蘆醇脂質體包封率的影響

由表1 可知，當大豆卵磷脂與膽固醇質量比為2∶1 和6∶1 時，得到的包封率較高，分別為88.9%和89.6%。一般而言，膽固醇因其表面活性劑作用可以提高水油混合型乳液的穩定性。因此，在構建脂質體載藥體系過程中其占比與制備后載藥脂質體的包封率呈正相關；但是，當膽固醇含量超過該比例范圍時，磷脂含量過低，易導致成膜困難，再加之人體所能消化的膽固醇量有限，無法利用和消化的膽固醇會在血液中積累。因此，考慮到脂質體的穩定性及膽固醇含量對人體的影響，選擇6∶1 作為大豆卵磷脂與膽固醇的最佳質量比。

2.1.2 脂藥比的影響

固定大豆卵磷脂與膽固醇的質量比為6∶1，改變大豆卵磷脂和白藜蘆醇質量比。

脂藥比對白藜蘆醇脂質體包封率的影響見表2。

表2 脂藥比對白藜蘆醇脂質體包封率的影響

由表2 可知，隨著脂藥比的增大，RES-L 包封率先上升后下降，說明在一定范圍內增加脂質體量可以更有效地包裹藥物，但當脂藥比超過20∶1 后，包封率下降，可能會造成脂質體及藥物的雙重損失。因此，選擇大豆卵磷脂與白藜蘆醇的最佳質量比為20∶1，白藜蘆醇脂質體包封率可達86.10%。

2.1.3 PEG-2000 質量濃度的影響

采用0.25，0.50，1.00，1.50 mg/mL 的PEG-2000磷酸鹽緩沖溶液進行洗膜，測定PEG-RES-L 包封率。

PEG-2000 質量濃度對PEG-RES-L 包封率的影響見表3。

表3 PEG-2000 質量濃度對PEG-RES-L 包封率的影響

由表3 可知，當PEG-2000 磷酸鹽緩沖溶液的質量濃度為1 mg/mL 時PEG-RES-L 具有最大的包封率。因此，選擇1mg/mL PEG-2000 磷酸鹽緩沖溶液進行脂質體制備。

2.2 白藜蘆醇脂質體的分子結構分析

RES，PEG-200 及PEG-RES-L 的紅外光譜圖見圖1。

圖1 RES，PEG-200 及PEG-RES-L 的紅外光譜圖

由圖1 可知，RES 在3 250 cm-1處有酚羥基吸收峰，在1 620，1 540，1 500 cm-1處有苯環吸收峰，在965 cm-1處有反式-C = C- 特征吸收，700 cm-1處為順式-C = C- 的特征吸收[9]。比較RES，PEG- 2000 與PEG-RES-L 的FTIR 圖譜發現，RES 的光譜特征消失。其原有的許多特征峰強度和峰型都發生了變化，強度大為減弱峰型也不再尖銳，甚至不再出現，這表明所形成的脂質體已經成功包埋了RES，使其分子振動受到限制而不能顯示其原有的紅外特征。

同時，PEG-2000 的羥基吸收峰3 430 cm-1變寬，2 889 cm-1吸收峰向長波數2 925 cm-1移動，表明在脂質體的形成過程中發生了藍移現象，1 467，1 345，1 280 cm-1的吸收峰也消失不見了，這些都表明在脂質體形成過程中發生了一定程度的化學反應，可能是由于RES 上的羥基結構與PEG-2000長鏈上的氧原子發生了氫鍵締合作用，將聚乙二醇成功修飾到白藜蘆醇脂質體上。

2.3 體外模擬消化研究

脂質體中藥物釋放機理復雜，藥物在脂質體中包埋的位置、藥物本身的分子大小和性質、脂質體的粒徑大小和密度及釋放環境等對藥物從膠囊內的釋放均有影響。將RES，RES-L 及PEG-RES-L 分別加入含有50 mL 的胃液中，于37 ℃下以轉速 100 r/min 反應120 min 后向透析袋中加入等體積腸液，繼續反應120 min，測定吸光度，計算RES，RES-L及PEG- RES-L 在4 h 內體外模擬胃腸道連續消化的結果。

PEG-RES-L，RES-L 與RES 模擬胃腸道連續消化釋放圖見圖2。

圖2 PEG-RES-L，RES-L 與RES 模擬胃腸道連續消化釋放圖

由圖2 可知，RES 在4 h 內的累計消化率最高，為45.88%；RES-L 次之，為35.82%；而PEG- RES-L的消化率最低，僅為26.44%，且具有更明顯的緩釋效果。從藥物釋放曲線可以看出PEG-RES- L，RES-L 在第0～30 min 內消化較快，而在第30～120 min 內消化平穩，這是由于在制備過程中有部分未被包裹的RES 沉淀吸附在其表面，當樣品進入模擬胃液后，這部分RES 會首先擴散溶解。此外，3 種樣品的消化率均在第120 min 時大量增加，體外消化體系中加入了模擬腸液，表明脂質體在模擬腸液的消化中消化速率增大，PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道的消化過程中累計釋放量更低，較未包裹的RES 及未經修飾的RES-L 更能在復雜的人體環境內維持穩定，且具有一定的緩釋效果，這對于提高白藜蘆醇在人體內的生物利用率有著積極意義。

經PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質體的消化情況見圖3。

圖3 經PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質體的消化情況

圖3 更為直觀地展示了PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道消化的情況，在連續測定的4 h 內，PEGRES-L 在胃液環境中釋放量占總釋放量的29.93%，而加入腸液后，胃腸液累計釋放量達70.06%。

2.4 穩定性測試

包封率是脂質體對于藥物的包封能力的直接體現，是否能夠長期穩定地包裹藥物，降低藥物泄漏率是評價脂質體穩定性的一個重要指標。表4 分別測定了RES-L 及PEG-RES-L 原液及離心后上清液在4 ℃避光保存時第2，4，6 天的吸光度值，并計算包封率。

白藜蘆醇脂質體穩定性分析見表4。

表4 白藜蘆醇脂質體穩定性分析

試驗結果發現，RES-L 經過6 d 的穩定性測試，包封率下降幅度較大，從77.25%下降至25.08%；而PEG-RES-L 在6 d 里包封率下降了18.32%，由此可見，經過PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質體在包封性能上更加穩定，更能抵抗長期儲存時環境的溫度、pH 值、濕度等因素對于脂質體穩定性的影響。

3 結論

利用薄膜超聲法制備了PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質體。單因素試驗最終確定大豆卵磷脂∶膽固醇（質量比） = 6∶1，大豆卵磷脂：RES（質量比） =20∶1，PEG-2000 磷酸鹽緩沖溶液質量濃度為 1 mg/mL 時，PEG-RES-L 的包封率最好。紅外光譜圖證實了RES 被成功包裹進脂質體內，PEG-2000 通過氫鍵作用修飾到了白藜蘆醇脂質體上。體外消化研究結果表明，修飾的PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道連續消化體系中消化率較低，為26.44%；而RES 及RES-L 的 消 化 率 分 別 為 45.88% 和 35.82% ；PEG-RES-L 在胃液中的累積釋放量僅為總釋放量的29.93%，遠低于在腸道的釋放量（70.06%）。PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道的消化較RES 及未修飾的RES-L 更能在復雜的人體環境內維持穩定。穩定性試驗證明，經過PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質體在包封性能上更加穩定，更能抵抗長期儲存時環境的溫度、pH 值、濕度等因素對于脂質體穩定性的影響。