加熱酶催化法提取葡萄皮中白藜蘆醇的改進研究

劉麗清，周三女

（寧德職業技術學院，福建 福安355000）

葡萄是世界公認的一種營養豐富的水果作物，含有豐富的有益健康的化合物。白藜蘆醇是葡萄的主要生物活性成分之一，是一種植物抗毒素，在環境因子的刺激下，在果皮、植物莖和根中積累。由于白藜蘆醇具有多種藥理作用，包括保護心臟、抗炎、抗癌和抗氧化特性[1-2]，受到了廣泛的關注。

近年來，白藜蘆醇在多種哺乳動物信號通路中的活性得到了廣泛的研究。例如，白藜蘆醇被認為是一種抗癌、抗衰老和神經保護劑，因為其可以控制那些調節DNA 合成和細胞周期的蛋白質，以及合成那些控制細胞增殖和應激適應的因子[3-5]。此外，白藜蘆醇被發現具有抗氧化性，通過用UVB 照射人的角質細胞（HaCAT） 顯示，白藜蘆醇以細胞凋亡和自噬結合的方式啟動皮膚光化學保護機制，用來預防皮膚癌[6]。

一般來說，葡萄皮、莖和種子組成的葡萄果渣占新鮮果實的20%～25%（按質量計算），含有大量的白藜蘆醇和其他生物活性物質[7]，然而，其通常是葡萄加工過程中的副產品。葡萄皮中含有豐富的白藜蘆醇及其糖苷，而果肉中的含量相對較低。因此，最近有人研究了葡萄皮或果渣作為抗氧化劑的可持續來源的可能性[8]。在葡萄皮中，大部分白藜蘆醇是以其糖苷的形式存在，稱為白藜蘆醇苷，白藜蘆醇苷不容易在小腸內吸收，在嚙齒類動物中，腸道表皮參與了白藜蘆醇苷對白藜蘆醇的代謝，以促進其吸收到血液中[9]。

考慮到白藜蘆醇具有顯著的潛在健康效益，且比白藜蘆醇苷更具生物可利用性，因此必須開發通過各種定量提取技術或直接白藜蘆醇苷脫糖的高效可行的方法來提高白藜蘆醇產量。多年來，從葡萄皮中提取白藜蘆醇一直具有挑戰性，因為它在水和其他常用溶劑中的溶解度較低。迄今為止，用乙醇水溶液（80/20，V/V） 在60 ℃下輕輕攪拌30 min，從感染發霉的葡萄皮中獲得了最佳的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的提取量[10]。為了進一步提高從植物源提取白藜蘆醇的產量，還研究了將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇的各種附加程序；這些步驟包括酸解、加熱和酶催化[11-13]。然而，這些程序的成本昂貴，而且往往需要最大程度的反應時間。近年來，在白藜蘆醇苷直接生物轉化的方法中設計并使用了高度固定化的食用黑曲霉和酵母[7]，優化了虎杖根的生物轉化條件，使虎杖根的白藜蘆醇產量是未處理虎杖根的11 倍。

試驗探索了運用酶催化與熱處理相結合從葡萄皮中快速、簡便、直接提取白藜蘆醇及其糖苷的方法。尤其是對葡萄皮進行預熱，使其細胞壁特性發生物理變化，從而有可能增加其對酶催化過程的敏感性，然后用包括exo-β-1,3- 葡聚糖酶和PG 酶VinoTaste 脯氨酸混合劑處理，以促進白藜蘆醇苷向白藜蘆醇的生物轉化。PG 水解成(1,4)-±-D- 半乳糖醛酸酶鏈作用于水果細胞壁降解，而exo-β-1,3-葡聚糖酶水解成非還原性末端多糖(1,3)-2-D- 葡聚糖。預熱條件優化，定量測定了葡萄皮提取物（GPEs）的抗氧化性能，確保加熱不會引起相關物質的變質。因此，研究旨在創造最佳條件來最大限度地從葡萄皮中回收白藜蘆醇和抗氧化成分。

1 材料和方法

1.1 原料及化學品

巨峰葡萄品種是福安本土種植的主要品種，果膠酶Rohament（纖維素酶，17 200 U/g），北京杰輝博高生物技術有限公司提供；果膠酶Pectinex（聚半乳糖醛酸酶，3300 PGN U/g）、脯氨酸VinoTaste [PG（2500 PG U/g） 和exo-β-1,3- 葡聚糖酶（75 U/g）、Viscozyme(endo-1,3(4)-exo-β-1,3-葡聚糖酶（100 真菌性exo-β-1,3-葡聚糖酶U/g）、2- 葡糖苷酶（10～30 U/g）、exo-β-1,3-葡聚糖酶（212 U/mg） 等。

白藜蘆醇苷（95%純度） 和白藜蘆醇（99%純度），國家標準物質中心提供；乙醇、甲醇和磷酸，上海聯試化工試劑有限公司提供；用于過濾高效液相色譜（HPLC） 分析樣品的注射器過濾器（PVDF濾膜，0.45 和0.2 μm），北京夢怡美生物科技有限公司提供；用于高效液相色譜分析的乙腈和甲醇均為高壓液相層析級，上海聯試化工試劑有限公司提供；除另有規定外，所有其他試劑均為分析級，無需進一步純化即可使用。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜分析（HPLC）：采用裝配有MD 2010 Plus 系列波長檢測器的2000 Plus 系列高效液相色譜對GPE 進行了HPLC 分析。樣本分離是使用雙層的5 μm C18色譜柱（150 mm×2 mm） 在0.8 mm/min的流速和一組梯度溶劑中分離，A/B（90/10，V/V）0～5 min，A/B（80/20， V/V） 5～25 min， 和A/B（90/10，V/V）為25～30 min（溶劑A：0.015 mol/L 磷酸水；溶劑B：乙腈）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取物中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的鑒定

采用UPLC 與配備電噴霧電離源的三倍四極質譜儀（LC-MS/MS 8040） 自動鑒定葡萄皮提取物中的反式白藜蘆醇和白藜蘆醇苷。UPLC 系統使用Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.6 μm） 在0.2mL/min 的流速下在梯度溶液從A/B（10/90，V/V） 到A/B （50/50，V/V） 運行0～3 min，以及在A/B（10/90，V/V） 溶液中運行3.1～7.0 min（溶劑A：0.024 mol/L甲酸乙腈溶液；溶劑B：0.024 mol/L甲酸水溶液）。標準物質和樣品直接注入光譜儀，注入體積都為5 μL。MS/MS 系統加熱毛細管溫度保持在250 ℃，氮氣干燥氣體保持8 L/min 流速。同時，創建了線性度為0.99的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的標準曲線。對相關的化合物進行鑒定，并通過選定的反應監測進行了定量，制備未加熱的葡萄皮樣品作為對照。結果用μg/g表示。

1.3.2 純白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇的去糖基化

初步制備了100 mg/mL 的白藜蘆醇苷原液作為母液。然后，在10 μL 母液中加入1 mL 的100 mmoL/L醋酸鈉溶液（pH 值5.0），分別用酶如：纖維素酶（344 U/mL），Viscozyme（2 U/mL），葡 糖 苷 酶（6 U/mL） 和VinoTaste脯氨酸（0.015 U/mL）在50 ℃分別處理10，20，30，60，120 min。酶催化水解完成后，加入1 mL 甲醇到500 μL 的反應混合物中，然后為了反應完全，在95 ℃持續加熱3 min。溶液通過注射器過濾器（PVDF，0.45 μm） 過濾，用HPLC 檢測其在303 nm 的吸光度，用超性能液相色譜- 質譜聯用儀（UPLC-MS/MS） 對樣品進行分析。標準白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的UPLC-MS/MS 譜圖和裂解模式和文獻[19]吻合。同時，制備了包含除酶以外的所有試劑的樣品作為對照進行分析。

1.3.3 凍干葡萄果皮樣品的制備

新鮮葡萄皮是通過擠壓葡萄果肉而得到。稱量約500 g 新鮮葡萄皮，與約250 mL 蒸餾水混合，在攪拌機中攪勻。將得到的混合物冷凍干燥，濃縮葡萄皮中所需的物質，便于后續分析處理。

1.3.4 加熱和酶催化聯用的提取白藜蘆醇的初步試驗

稱量冷凍干燥樣品0.5 g，加入約3 mL 蒸餾水，95 ℃條件下加熱1 h。然后，蒸干水分，用3 mL 5 U/mL 的2 - 葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸在單獨的試管里進行酶催化處理。然后，將其溶解在醋酸鹽緩沖液（pH 值5.0） 中，用適當體積的乙醇制備乙醇水溶液（80/20，V/V），加入乙醇水溶液，終止反應。然后按照上述方法提取白藜蘆醇[10]。簡單地說，白藜蘆醇的提取是在60 ℃下加熱30 min，用乙醇- 水混合物（80/20，V/V） 在熱搖瓶中進行。然后，最終提取物蒸發干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），用注射器過濾器（Whatman PVDF 過濾器，0.45 μm） 進行過濾，最后用高效液相色譜法對提取液進行分析。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量用μg/g 表示。

1.3.5 優化從葡萄中提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的預熱溫度

稱量冷凍干燥樣品0.5 g，加入約3 mL 蒸餾水，隨后在不同溫度（35，55，75，95 ℃） 條件下加熱10，30，60 min。將室溫下未加熱的葡萄皮作為參照，再采用之前所述的方法提取白藜蘆醇[10]。然后，將最終提取物蒸發干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），用注射器過濾器（Whatman PVDF過濾器，0.45 μm） 進行過濾。同時，制備一組未加熱和酶處理的葡萄樣品（室溫，約25 ℃） 作為對照。最后，用高效液相色譜法對提取液進行分析。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量用μg/g 表示。

1.3.6 加熱和酶催化處理葡萄皮的聯合應用

稱量冷凍干燥樣品0.5 g，加入約3 mL 蒸餾水，在95 ℃條件下加熱10 min，風干，緩慢與3 mL 醋酸鈉緩沖液（pH 值5.0） 混合，然后分別用VinoTaste脯氨酸（exo-β-1,3- 葡聚糖酶，5 個單位），Pectinex（聚半乳糖醛酸酶PG，5 個單位），exo-β-1,3- 葡聚糖酶（5 個單位），2- 葡糖苷酶（5 個單位），以及Pectinex和exo-β-1,3-葡聚糖酶（5 個單位） 混合物進行酶催化處理。用0.1 mol/L HCl 溶液或NaOH 溶液調節pH 值至5.0，反應的混合物在熱搖瓶里50 ℃條件下培育60 min。未經加熱和酶催化處理過的室溫下的葡萄皮作為參照。然后，按照前面提到的最佳條件進行白藜蘆醇的提取。最終提取物蒸發干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），通過沃特曼過濾器（Whatman PVDF過濾器，0.2 μm） 進行過濾用于HPLC 分析。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量用μg/g 表示。

2 結果與分析

2.1 純白藜蘆醇苷向白藜蘆醇的酶轉化

為了創造最佳條件以便從白藜蘆醇的前導糖苷中產量最大化獲得白藜蘆醇，純白藜蘆醇苷用不同的酶進行催化處理，如纖維素酶、Viscozyme、2-葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸。對纖維素酶和Viscozyme進行了篩選，比較了纖維素酶、Viscozyme與2- 葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸在白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇過程中的效率。研究發現，白藜蘆醇苷在40 ℃條件下培育10～120 min，然后去糖基化，2-葡萄糖苷酶和VinoTaste脯氨酸比纖維素酶和Viscozyme更為有效（圖1）。用VinoTaste脯氨酸催化得到的白藜蘆醇產量比2- 葡糖苷酶、Viscozyme和纖維素酶分別提高了6.09%，34.29%，81.33%。因此，在后續試驗中采用VinoTaste脯氨酸。另外，在使用VinoTaste脯氨酸催化白藜蘆醇苷去糖基化的時間過程圖中表明，純白藜蘆醇苷在50 ℃條件下，用酶催化處理60 min 后可全部轉化為白藜蘆醇（圖2）。

不同酶作用下白藜蘆醇苷向白藜蘆醇轉化率見圖1，在不同加熱時間VinoTaste脯氨酸作用下白藜蘆醇苷向白藜蘆醇的轉化率見圖2。

圖1 不同酶作用下白藜蘆醇苷向白藜蘆醇轉化率

圖2 在不同加熱時間VinoTaste脯氨酸作用下白藜蘆醇苷向白藜蘆醇的轉化率

在所有酶催化試驗中，盡管報道了纖維素酶在白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇的過程中的作用，但其作用是最小的[14]。根據供應商的分析，Viscozyme同樣被報道具有纖維素酶的功用，有望以與纖維素酶類似的方式完成白藜蘆醇苷的去糖基化，所以和其他的酶一起進行了測試。用VinoTaste脯氨酸參加反應得到白藜蘆醇的高回收率可能要歸功于2-1，3-葡聚糖酶的活性，2-1，3- 葡聚糖酶直接水解2-1，3 鏈作用于白藜蘆醇苷。在白藜蘆醇苷水解過程中，采用合適的酶直接攻擊2-1，3- 鏈是非常重要的。結論和之前的報道一致，在60℃，pH 值5.0，基質質量濃度為40 g/L 的最佳酶催化條件下，用5 U/mL的白藜蘆醇苷、2-D- 葡糖苷酶活化4 h，完成白藜蘆醇苷向白藜蘆醇生物轉化，從米曲霉中提煉的白藜蘆醇苷-2-D- 葡糖苷酶在這一過程中是有作用的[15]。為了解決產量低、工業相溶性差的問題，研究人員嘗試了多種白藜蘆醇苷向白藜蘆醇轉化的方法，包括微生物轉化和酸水解，收效甚微[16-17]。

2.2 葡萄皮中提取白藜蘆醇的加熱溫度和時長的作用

考慮到預熱和酶處理是白藜蘆醇提取的關鍵決定因素[10，18]，葡萄皮在不同溫度和時間下加熱，以確定最佳的預熱條件（表1）。在不使用酶的情況下，單獨在75 ℃或更高溫度下熱處理10～60 min，白藜蘆醇的提取率明顯提高。葡萄皮在75 ℃下熱預處理60 min 和95 ℃下熱預處理10 min 用乙醇水溶液（80/20，V/V） 作為萃取溶劑產生的白藜蘆醇最高提取率為113.54 μg/g 干葡萄皮、113.99 μg/g 干葡萄皮。這些提取率明顯高于其他加熱條件下。

預加熱對葡萄皮中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇提取的影響見表1。

表1 預加熱對葡萄皮中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇提取的影響

另外，葡萄皮提取物中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量不進行熱預處理時分別是19.09，20.65 μg/g干葡萄皮。通過對比，95 ℃下預熱10 min 后，提取物中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇含量分別提高2.2 倍和 5.5 倍，統計檢驗差異p＜0.05。表明在高溫下對葡萄皮進行短期熱處理對提高白藜蘆醇的提取率至關重要。

總的來說，選擇95 ℃預熱10 min 作為后續工藝的最佳條件。為了防止加熱時間過長導致葡萄皮中其他組分的分解，葡萄皮的短暫熱處理是最合適的。

2.3 葡萄皮中提取白藜蘆醇的加熱和酶催化聯用的作用

相比于沒有加熱的參照物，預加熱葡萄皮然后酶催化處理明顯提高了白藜蘆醇及其糖苷的提取量（表2）。特別是葡萄皮預熱后使用VinoTaste脯氨酸白藜蘆醇的含量顯著提升到了93.44 μg/g 干葡萄皮。這是沒有加熱的參照物的2 倍。另外，白藜蘆醇苷的含量保持不變。相對于加熱的參照物，使用2- 葡糖苷酶不能顯著增加白藜蘆醇的含量，僅為81.02 μg/g干葡萄皮。因此，結果明確表明VinoTaste脯氨酸有效催進了預加熱葡萄皮中的白藜蘆醇配糖轉化為苷配基的生物轉化。

加熱和酶聯合作用對白藜蘆醇提取量的影響見表2。

表2 加熱和酶聯合作用對白藜蘆醇提取量的影響/μg·g-1

此外，制備了預熱并酶組分如PG和exo-β-1,3-葡聚糖酶催化處理的葡萄皮，用來探索VinoTaste脯氨酸酶組分的作用機理。用具有PG 活性的Pectinex處理加熱過的葡萄皮。結果表明，在保持白藜蘆醇含量不變的情況下，白藜蘆醇苷的提取率明顯提高。相比較而言，用exo-β-1,3-葡聚糖酶單獨處理預熱的葡萄皮沒有表現出和加熱過的參照物有明顯區別。有趣的是，Pectinex和exo-β-1,3-葡聚糖酶聯合使用則清楚地表現出與用VinoTaste脯氨酸處理過的樣品相近的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇含量。因此，這些結果表明PG 進一步提升了在預熱過的葡萄皮中白藜蘆醇糖苷的提取能力，盡管如此，隨后的去糖基反應只有exo-β-1,3-葡聚糖酶存在的情況下才能進行。因此，PG 增強了VinoTaste脯氨酸中的exo-β-1,3-葡聚糖酶的酶催化作用，可能是通過釋放對白藜蘆醇糖苷基質易于伴隨exo-β-1,3-葡聚糖酶輔助水解，從而從預熱的葡萄皮樣品中提取出大量的白藜蘆醇。

不預熱處理時，酶法從葡萄皮中提取大量的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的效果不佳（表1），由此可見，加熱處理引起了葡萄皮結構變化，這對于促進白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取，以及白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇的有效酶催化反應是至關重要的。同時，使用UPLC-MS/MS 對樣品進行分析，監測白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇的情況，通過對白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的分解模式的評價，UPLC-MS/MS 得到的譜圖表明，在消耗白藜蘆醇苷的同時產生了白藜蘆醇。這2 種色譜圖都顯示白藜蘆醇在227，185，143 m/z處的特征峰，表明GPE 中的白藜蘆醇苷去糖基化導致白藜蘆醇的生成[19]。

3 結論

一種從白藜蘆醇苷轉化和從葡萄皮中提取天然白藜蘆醇的有效方法。加熱后酶處理可顯著提高白藜蘆醇的提取率。特別是95 ℃條件下預熱葡萄皮為10 min，后續用包含exo-β-1,3- 葡聚糖酶和PG 酶VinoTaste脯氨酸在50 ℃條件下處理60 min，顯著增加用乙醇水溶液（80/20，V/V） 萃取白藜蘆醇的產量達50%。上述白藜蘆醇提取方法有望為食品工業提供一種低成本的工業替代方法。