厭氧反硝化體系對磺胺嘧啶的共代謝降解特性

鄭杰蓉,汪素芳,趙曉嬋,李培瑞,董 靜,岳秀萍

(太原理工大學環境科學與工程學院,太原 030024)

磺胺類藥物作為一種人工合成的抗生素,已廣泛應用于人類醫療及養殖行業,目前在制藥廢水、生活污水和地表水中經常可以檢測出磺胺類抗生素殘留,它們會對人體健康造成一定影響,因此得到了人類社會越來越廣泛的關注[1-3]。磺胺嘧啶(sulfadiazine,SDZ)是磺胺類藥物的代表,屬于較難生物降解的含氮雜環化合物,在進入自然水體后若不能得到有效降解,不僅能對水生生物和水體產生一定的影響,還會通過食物鏈富集作用或水循環進入人體,最終會威脅人類健康[4-5]。因此,為有效去除環境中的SDZ,對其降解技術及原理進行深入研究顯得尤為必要。生物處理技術由于其具有設備簡單、操作方便、二次污染小、運行成本低等特點，被廣泛應用于污染物的去除。目前,與SDZ生物降解相關的研究主要是通過提純菌株來進行,然而由于某些純化菌株對SDZ的降解路徑比較單一,使得氮雜環部分積累較多,因此SDZ的礦化程度受限[6-7]。到目前為止,采用混合菌群來降解污水中SDZ的報道較少。Wang等[8]研究了雙室微生物燃料電池(microbial fuel cell,MFC)對SDZ的生物降解特性,結果表明不同功能的微生物菌群共同作用,不僅使反應體系中SDZ得到更加徹底的降解,也有一定潛力去降低反應體系的出水生物毒性,在實際工程應用中具有良好的發展前景。

1 材料與方法

1.1 活性污泥的馴化

活性污泥取自晉中市某一污水處理廠(SBR工藝)濃縮池,反應器為500 mL厭氧反應器,構型如圖1所示。活性污泥與礦物質鹽溶液體積比為1∶10,總體積為300 mL。每升混合液中微生物生長所需的營養物質如下:SDZ,NaAc (200 mg),NaCl (0.5 g),微量元素(10 mL)[11],維生素 (0.01 mL),K2HPO4(0.02 g),KH2PO4(0.02 g),NaNO3(COD/N=5)。研究設單基質組 (SDZ) 和共基質組 (SDZ和NaAc) 兩組對照,每組對照各設置3個平行實驗。反應器啟動后,進水SDZ濃度從10 mg/L逐步增加,梯度為10 mg/L,更換反應液的周期為10 d。每個進水SDZ濃度持續3個周期。每個周期反應液更換完成后,先驗證反應器氣密性,之后連續充氮15 min使其保持嚴格的厭氧環境,最后將反應器置于30 ℃恒溫振蕩培養箱中進行培養。

圖1 反應器構型Fig.1 Reactor configuration

1.2 分析方法

1.2.1 基本指標檢測

1.2.2 碳平衡試驗

為評價硝酸鹽厭氧反硝化體系中,以乙酸鈉為共代謝基質時SDZ的礦化程度,當反應器中SDZ初始濃度為50 mg/L時,反應液更換完成后在0 h和88 h分別取樣,用孔徑為0.45 μm的無機濾膜過濾水樣,通過TOC分析儀(TOC-V CPH,島津公司)測定總有機碳(total organic carbon,TOC)和無機碳(inorganic carbon,IC)濃度。此外,用元素分析儀測污泥中的生物量碳。在排氣口接200 mL氣袋收集反應器中的氣體,用氣相色譜儀測定其中CO2和CH4的濃度。

1.2.3 SDZ中間產物的測定

甲酸水(0.5%) (A)為水相,乙腈(B)為有機相,采用UPLC-MS/MS[Waters UPLC(I-class)]對SDZ代謝產物的水樣進行分析。流動相比例梯度為0～4 min:A%∶B%=80∶20；5～7 min:A%∶B%=60∶40；8～9 min:A%∶B%=80∶20；流速:0.3 mL/min。PDA檢測采用200～360 nm波長連續掃描。MS/MS分析使用電噴霧電離(ESI+和ESI-)在50～500m/z的質量掃描范圍內進行。

1.2.4 微生物群落的測定

微生物馴化5個月后,取出反應器底部的活性污泥通過高通量測序方法測定其中的微生物群落(上海凌恩)[12]。采用土壤DNA分離試劑盒提取樣品中DNA來擴增16S rRNA的V3-V4區域,515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5’-CCGTC-AATTCMTTTRAGTTT-3’)作為引物。最終采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,并統計各樣本的群落組成。

1.2.5 出水生物毒性測定

為評價共代謝厭氧反硝化體系降解SDZ后的出水生物毒性,實驗以大腸桿菌為受試菌體,在SDZ初始濃度為50 mg/L時,對周期末反應液進行了毒性檢測,步驟如下。

(1)將周期末反應液在高速離心機中離心(8 000 r/min,20 min) 后,用直徑為0.22 μm的有機膜過濾,使用該反應液配制LB培養基(實驗組)。

(2)用超純水配置LB培養基,并將其配置成一定濃度梯度的SDZ培養液,其中0 mg/L SDZ組為空白組,其余組為SDZ組。

(3)使用LB培養基將純化的大腸桿菌稀釋10倍,取100 μL加入上述空白組,SDZ組和實驗組,在37 ℃條件下培養24 h后,用酶標儀測其OD600。通過SPSS軟件對SDZ組和空白組OD600的顯著性差異進行分析(*P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 共代謝體系中SDZ的厭氧反硝化降解

反應器啟動后,隨著微生物的馴化,共代謝厭氧反硝化體系對SDZ的降解效率逐漸提高。微生物馴化2個月時,SDZ初始濃度為20 mg/L,10 d內反應體系中微生物對SDZ的降解率為66.13%。微生物馴化3個月時,30 mg/L的SDZ在120 h內降解率可達76.15%。第5個月SDZ初始濃度為50 mg/L時,88 h內微生物對SDZ的降解率為97.36%,微生物對SDZ的降解效率有了很大提高。

為體現以SDZ和NaAc為底物時厭氧反硝化體系中微生物菌群對SDZ的降解優勢,實驗對比了在厭氧反硝化體系中有無NaAc存在時微生物菌群對SDZ的降解效率。如圖2所示,SDZ初始濃度為50 mg/L時,在硝酸鹽厭氧反硝化體系中,以NaAc為共代謝基質時88 h內微生物對SDZ的降解率為97.36%；無NaAc存在時88 h內混合菌群對SDZ的降解率僅為57.02%。由此可見,在微生物馴化階段,NaAc會促進混合微生物菌群對SDZ的厭氧反硝化降解。本實驗在混合菌群厭氧反硝化體系中以NaAc作為額外的電子供體,一方面可使那些難以在SDZ體系中存活的微生物參與到目標電子受體的還原反應中,加速微生物對SDZ的代謝[13],另一方面,NaAc作為共代謝基質存在于硝酸鹽體系中時,可為微生物的生長提供能量,從而促進混合菌群對SDZ的降解[14]。

圖2 SDZ的去除效率Fig.2 The removal efficiency of SDZ

圖3 反應器中 和變化Fig.3 The changes of and

2.2 碳平衡實驗

實驗檢測了以SDZ和NaAc為底物時,88 h內硝酸鹽厭氧反硝化體系中的碳平衡情況,如表1所示。SDZ初始濃度為50 mg/L時,反應液中的初始TOC濃度為116.3 mg/L,88 h后TOC為7.9 mg/L,降解率為93.21%,其中乙酸鈉所貢獻的TOC降解率為97.20%,SDZ所貢獻的TOC降解率為85.53%,高于相關研究中純種菌株對SDZ的礦化程度[16-17]。反應液中約13%和33.4%的碳分別轉化為CH4和CO2,此時體系中仍有23.5 mg/L無機碳和5.6 mg/L有機碳,分別占反應液中初始總碳的19.71%和4.7%。此外,生物量碳從15.32 mg/L提高到44.12 mg/L,生物量隨著TOC的減少而增加,可見反應體系中SDZ和NaAc為微生物的生長提供了營養物質。

表1 碳平衡分析Table 1 Carbon balance analysis

2.3 SDZ降解路徑推測

圖4 SDZ降解路徑Fig.4 Proposed pathways

這4條代謝路徑主要包括SDZ水解,磺胺部分硫的還原,嘧啶部分C—N鍵的斷裂,氨基氧化等反應。這一系列反應由體系中不同功能的微生物菌群共同完成,從不同的反應路徑對SDZ進行了生物降解,體系中SDZ得到更加徹底的去除。

2.4 與SDZ降解相關的功能菌群分析

反應器內活性污泥馴化5個月后,為測定共代謝厭氧反硝化反應體系中與SDZ降解相關的功能菌群,對污泥中的微生物菌群進行了高通量分析。樣品包括原污泥樣品(空白組S1),實驗中以SDZ和NaAc為底物時經過厭氧反硝化過程馴化后的污泥樣品(共基質組S2),以SDZ為單一底物進行厭氧反硝化馴化后的污泥樣品(單基質組S3)。如圖5所示,在高通量測序結果中,3種污泥樣品中的微生物群落表現出十分明顯的差異。S2中檢測出一些功能菌群,與S1和S3相比有明顯的優勢,這些微生物主要包括厭氧反硝化菌,脫氮菌和脫硫菌等。

圖5 功能微生物在屬水平的相對豐度Fig.5 Relative abundance of functional bacteria at genus level

BacteroidetesVC2.1Bac22_norank(1.52%)是抗生素耐藥基因(ARG)的潛在宿主[19],本實驗中BacteroidetesVC2.1Bac22_norank在S2中占有優勢,可推測這種微生物可在磺胺類抗生素廢水中大量繁殖。Ignavibacterium(22.70%)能以含硫化合物為電子供體達到去除體系中難降解污染物的目的,同時對一些抗生素具有耐藥性[20],因而可以推測這種微生物可以通過硫的代謝來降解反應體系中的SDZ。研究發現Opitutus、Planctomicrobium、AKYG587、Thauera、Aquamicrobium和Azoarcus等微生物菌群均可參與反硝化過程,在脫氮的同時降解體系中的難降解有機物。Opitutus(0.23%)和Planctomicrobium(1.25%)可參與環境中的氮循環,主要將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽來進行脫氮[21]。AKYG587(1.43%)可通過反硝化作用將含氮化合物轉化為氮氣和一氧化二氮[22]。Aquamicrobium(2.35%)可將含氮雜環裂解,釋放出單質硫,使得反硝化體系中的硝酸鹽最終轉化為亞硝酸鹽[23-24],從而促進磺胺類藥物的去除。Azoarcus(10.78%)是一種新型的反硝化菌,在厭氧條件下通過環裂解途徑降解各種芳香族化合物,其中包括一些有毒和難降解的化合物,在抗生素生物降解過程中起到很大的作用[25-26]。Rivibacter(5.02%)可降解復雜的有機化合物,諸如脂肪酸、多胺等,因而可以推測這種微生物對SDZ的去除也有一定潛力[27]。Thauera(31.02%)屬于反硝化菌的范疇,可通過不同的路徑進行脫氮,又與芳香化合物的降解相關[28-29],因而可在含有SDZ的污水中大量存在。

Anaerolinea(1.16%)和Bellilinea(0.64%)屬于Anaerolineaceae,研究表明,Anaerolineaceae與厭氧環境中芳烴、環烷芳烴、含氮硫化合物的降解相關,因此可推測Anaerolineaceae對磺胺類藥物的降解也有一定的作用[30]。與此同時,在直鏈烷基苯磺酸鹽 (LAS)濃度很高的污水中,Bellilinea(0.63%)也很多[31],它可能與SDZ中間代謝產物的降解相關。Truepera(0.56%)可以吸收各種有機酸和氨基酸[32],對該反應體系中的氨氮具有一定的去除效果,這與氨氮濃度在后期逐漸降低具有一定關系。由此可見,在混合菌群存在的共代謝硝酸鹽厭氧反硝化體系中,具有反硝化、脫硫、脫氮等不同生物功能的微生物菌群共同作用,有潛力使SDZ得到更為徹底的去除。

2.5 產物生物毒性

對空白組、SDZ組和實驗組對大腸桿菌的抑制程度進行評價。如圖6所示,對比了不同SDZ濃度和空白組,實驗組在第24 h時的OD600。

圖6 空白組、SDZ組、實驗組OD600對比Fig.6 OD600 of blank group,SDZ group and experimental group

當SDZ濃度大于或等于8 mg/L時,SDZ組與空白組的OD600有顯著性差異。此外,對空白組,實驗組和對照組3組實驗中大腸桿菌在24 h的OD600進行比較,結果表明,OD600的大小順序為實驗組>空白組>SDZ組。在本實驗中,SDZ組對大腸桿菌的生長有明顯的抑制作用。實驗組大腸桿菌的OD600高于空白組可能是由于周期末SDZ代謝產物中殘余的有機物及無機物為大腸桿菌的生長提供了營養物質,故反應器出水中殘留的有機物無生物毒性。因而在硝酸鹽厭氧反硝化體系中,以NaAc為共代謝基質時,混合菌群降解污水中SDZ后,其出水不會對環境造成二次污染。

3 結論

以NaAc為共代謝基質時,硝酸鹽體系中混合菌群厭氧反硝化降解污水中SDZ主要性能表現如下。

(1)活性污泥馴化5個月后,反應體系中微生物菌群對SDZ有明顯的去除效果。88 h內SDZ (50 mg/L)的去除率可達97.36%,比單基質體系高出40.34%,乙酸鈉作為額外的電子供體,加速了微生物菌群對SDZ的代謝；88 h內SDZ所貢獻的TOC降解率為85.53%,礦化程度高于其他相關研究。

(2)該體系中SDZ生物降解主要有4種途徑,包括SDZ水解、磺胺部分硫的還原、嘧啶部分C—N鍵的斷裂，氨基氧化等反應；降解SDZ的功能菌群以反硝化菌和脫硫菌為主(如Ignavibacterium、Azoarcus、Rivibacter等),共同促進SDZ的生物降解。