內蒙古西部地區土壤真菌的多樣性分析

馬 強,夏冬雙,武志華,王雪寒,任興波,丁一秀,劉惠榮

(內蒙古農業大學生命科學學院,呼和浩特 010018)

真菌是土壤微生物的主要成員之一,它可以降解土壤中復雜組分,部分真菌在提高植物抗逆性、維持植物正常生長方面發揮巨大作用[1],對土壤環境產生重要影響。因此研究土壤真菌的多樣性對于土壤環境十分重要。目前土壤真菌僅被分離出很小一部分,從真菌對人類生產生活的重要程度來看,發現更多有利于人類的真菌是十分有必要的。

內蒙古西部地區主要有鄂爾多斯、烏海、包頭、巴彥淖爾和阿拉善,是中國重要的農牧業產區[2]。由于該地區有荒漠、戈壁、草原、山地等不同地形,且氣候類型為溫帶大陸性季風氣候,較為干旱缺水,再加上一些人為破壞,導致該地區水土流失,荒漠化程度高[3],如鄂爾多斯與阿拉善等地荒漠化嚴重,其土壤類型主要為灰棕漠土和風沙土,而西部其余三地主要為棕鈣土。內蒙古西部地區土壤類型復雜多樣,有機質的含量、pH、土壤利用方式、植物種類的不同,都會對真菌的分布產生不同程度的影響[4]。

目前各個領域針對微生物菌群多樣性的分析方法主要分為培養法和非培養法兩種。培養法由于條件限制只能分離鑒定出少數微生物；而非培養法則是通過提取所有樣本的總DNA,通過PCR-DGGE擴增遺傳區域后,可全面分析樣品中微生物菌群的多樣性。非培養法的主要研究方法有變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技術、單鏈構象多態性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析、末端限制性片段長度多態性(terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析等[5]。聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳 (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)[6-7]是微生物群落分析中最為常用的一種方法,具有快速、穩定等優點,在各個領域中均被頻繁使用,如，荒漠、山丘等土壤微生物多樣性研究。現利用PCR-DGGE技術對內蒙古西部地區的土壤真菌進行多樣性分析,為該地區土壤真菌多樣性研究及完善做好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

采集內蒙古西部地區不同土壤類型得土壤樣品,并根據不同土壤類型的不同利用方式進行土樣的采集,在內蒙古西部地區共采集到的170份土樣,置于-80 ℃冰箱備用。土壤樣品信息如表1所示。

表1 土壤樣品信息Table 1 Information of soil samples

1.1.2 PCR引物

所用的引物參照呂新等[8]的研究選用真菌 18S rRNA 基因片段PCR擴增引物,通過生工生物工程(上海)股份有限公司合成,如表2所示。

表2 本文所用的引物Table 2 The primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 土壤總DNA提取

將李靖宇等[9]與Leff等[10]采用的土壤DNA的提取方法相結合優化之后進行實驗,以提高DNA的產量。

1.2.2 PCR反應條件

采用50 μL反應體系:10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物各0.4 μL、ExTaq 0.4 μL、模板1 μL、加無菌雙蒸水至50 μL。PCR擴增條件:95 ℃ 2 min；95 ℃ 50 s、65～55 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s、10個循環(每個循環退火溫度降低1 ℃)；94 ℃ 35 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s、72 ℃ 10 s,25個循環。

1.2.3 DGGE方法

采用 Bio-Rad 電泳系統，變性劑梯度為20%～40%的8%聚丙烯酰胺凝膠。上樣后120 V恒壓 5 min 后,再75 V、150 W恒壓14 h。染時用硝酸銀染[11]15 min后再洗脫10 min。洗脫后拍照,用Quantity One 4.6.2分析。由于土壤樣品眾多,采集范圍較廣,提取到的真菌群落的基因型差異較大,可分別用香農指數H′、豐富度S、均勻度Eh等來進行比較,計算公式為

(1)

Eh=H′/Hmax=H′/InS

(2)

R=S

(3)

式中：S為某一個樣品中(即每個泳道)所有條帶的和；Pi為每個泳道中屬于第i種的個體比例,如總的樣品數為N,則第i種個體數為ni,那么Pi=ni/N。之后將所需的目的條帶進行切膠回收后進行PCR擴增并送測序。

1.2.4 序列測定及分析

在NCBI的數據庫中,對本研究得到的測序結果進行Blast比對分析,使用Mega 5.1軟件進行系統發育樹的構建。

2 結果與分析

2.1 土壤真菌多樣性

2.1.1 真菌18S rRNA

由于引物前的GC序列重復度高,因此在對真菌18S rRNA基因片段進行PCR擴增時難度較大,通過反復實驗,找出真菌PCR的最適反應條件,得到片段大小為350 bp的清晰條帶,如圖1所示。

M為DNA Marker；1～9為樣品BT13、ERDS15、BT4、BM29、BM30、BM25、ERDS32、ERDS4、AL31總DNA的擴增產物圖1 真菌18S rRNA 基因片段PCR產物電泳結果圖Fig.1 PCR products of the fragment of 18S rRNA gene of fungi

2.1.2 PCR產物的DGGE分析

用DGGE電泳檢測PCR純化后的產物。如圖2所示,用Quantity One 4.6.2 進行分析。結果顯示,不同泳道中的條帶與數目差別較大,優勢條帶較少。

1#～12#樣品為BT13、ERDS13、BM33、BM30、BM22、ERDS31、ERDS4、AL32、ERDS30、ERDS29、ERDS6、ERDS32的PCR-DGGE結果圖2 部分土樣真菌18S rRNA 基因片段PCR產物DGGE圖譜Fig.2 DGGE image of PCR products of 18S rRNA gene of fungi of partial soil samples

2.2 土壤真菌多樣性分析

用Quantity one軟件來分析圖2,得到條帶分布及強度示意圖(圖3)。由圖3可知，不同土壤樣品中的真菌DGGE條帶分布有著明顯區別。在利用方式均為耕地的2#、6#、10#、11#泳道的土樣中,2#為風沙土,6#、10#為灰鈣土,11#為栗鈣土,從泳道的條帶多少來看,2#、11#泳道的條帶數較多,而6#、10# 泳道的條帶數則相對較少,由此可知,在內蒙古西部地區,相同利用方式的土壤中,不同土壤類型中真菌的多樣性差別較大。6#、9#、10#、12#均為灰鈣土,但它們的土壤利用方式不同,如6#、10#的土地利用方式為耕地、9#為林地、12#為草地,由圖3可知,6#、9#有11個條帶,10#有12個條帶,12#有30個條帶,9#的條帶大都分布在膠圖的中下部,而 6# 則分布在中部,9#的優勢條帶也與6#明顯不同,且12#的優勢條帶與6#、9#、10#的分布大部分不相同,它們的條帶數目與強度明顯不同,說明土壤利用方式的不同對真菌的分布影響較大；在土壤類型及利用方式均相同的6#、10#土樣中,圖3顯示其條帶數及優勢條帶基本相似,可見微生物類群也應該相差不大；來自巴彥淖爾的3#土樣與來自阿拉善的8#土樣的土壤利用方式均為未利用的荒漠風沙土,如圖3所示,它們的條帶數分別為13、7條,它們不光條帶數并不完全相同,且優勢條帶也不一致,此外8#土樣優勢條帶具有特異性,說明真菌的分布除了受土壤類型及利用方式的影響外,還可能與其他地理環境條件有關。

圖3 部分土壤樣品真菌18S rRNA基因的PCR產物DGGE電子圖譜(與圖2對應)Fig.3 DGGE electron image of PCR products of fungal 18S rRNA gene of partial soil samples (Corresponding to Fig.2)

將真菌18S rRNA基因的DGGE圖譜標準化,各土壤類型中真菌的分布特點用香農指數、豐富度、均勻度等多樣性指數來分析。香農指數是微生物的多樣性指數[12],其數值越大多樣性越豐富；豐富度指一個群落結構中的物種數目；均勻度指數越接近1,群落結構組成越均勻[13]。表3所示為各土壤類型的香農指數、豐富度、均勻度計算平均值,其中,棕鈣土的香農指數、豐富度的平均值均為最高,草甸土香農指數、豐富度的平均值均為最低,均勻度指數的平均值則不同,均勻度指數平均值最高的為灰色森林土,最低的為栗鈣土。由此可見,不同土壤類型中的真菌數目差距較大,棕鈣土中的真菌數目最豐富,石質土與栗鈣土的真菌數目相對較少,而草甸土的真菌數目最少,其他類型的土壤中真菌數目居中；所有土壤類型的均勻度指數均十分接近于1,可見在內蒙古西部地區采集到的所有土壤樣品的結構組成都比較均勻,真菌群落結構受土壤類型的影響不明顯。

表3 不同土壤類型真菌多樣性指數Table 3 Fungal diversity index of different soil types

將實驗用到的土壤樣品按照其不同的利用方式分為耕地土、林地土、草地土、未利用土地后,將不同利用類型土地的香農指數、豐富度、均勻度等計算平均值后進行統計,如表4所示。各利用類型土壤的香農指數與豐富度的規律一致,其平均值由高到低為草地土>耕地土>林地土>未利用土壤,說明耕地土與草地土的真菌物種數目要明顯高于林地土與未利用土壤,未利用土壤真菌物種數目最少。

表4 不同土壤利用類型真菌多樣性指數Table 4 Fungal diversity index of different utilization patterns of soils

2.3 土壤真菌多樣性與理化性質的關系

武志華等[13]測定了不同類型土壤樣品的pH、含水量、有機質等的含量,發現在土壤類型中,其理化性質差異較大。在內蒙古西部地區的土壤樣品中,中性土壤占27.06%,微堿性土壤占66.47%；在采集到的不同類型土壤樣品中,除含水量較高的栗褐土之外,內蒙古西部地區大部分土壤類型的含水量較少；水解氮及有機質在沼澤土中的含量最高,而其余土壤類型的水解氮含量均處于較低狀態；有機質在大部分土壤類型中的含量較少,僅在灰褐土與草甸土的含量適中；沼澤土、栗褐土、鹽土、潮土、灰褐土的速效鉀含量適中,剩余土壤類型的速效鉀含量處于較低水平。

根據土壤樣品利用方式不同將各個地區土壤樣品的環境參數進行分析,如表5所示。pH在不同利用方式的土壤中相差不大；含水量由高到低分別為耕地>林地>草地>未利用土壤；水解氮的含量由高到低分別為林地>耕地>草地>未利用土壤；速效鉀含量由高到低分別為草地>林地>耕地>未利用土壤,其中未利用土壤的水解氮、速效鉀含量明顯低于其他3種利用類型；未利用土壤的有機質含量最低,林地的有機質含量遠遠高于其他3種利用方式,這可能是由于林地長期以來的落葉積累、光照強度低等因素導致有腐殖質含量高；耕地的有效磷含量最高,未利用土壤與草地的有效磷含量相差不大,林地的有效磷的含量明顯低于其他 3種土地利用類型。

表5 不同利用方式土壤環境參數的平均值Table 5 Average value of soil environmental parameters under different utilization methods

將本實驗用到的所有土壤樣品的pH、含水量等環境參數與真菌香農指數、豐富度用SPSS軟件進行相關性分析,結果如表6所示。由表6可知,除pH、有機質的含量與香農指數和豐富度的相關性為負相關關系外,其余環境參數與香農指數和豐富度均正相關。由表6可知，以上土壤環境參數指標與真菌多樣性指數相關性可忽略不計。顯示只有pH會對真菌分布的均勻度有所影響,在中性偏微酸性的pH范圍內,pH越高,真菌分布越均勻。

表6 土壤理化性質與真菌多樣性指數的相關系數Table 6 Correlation coefficient between soil environmental parameter and fungal diversity index

2.4 土壤真菌18S rDNA系統發育樹構建

因部分優勢條帶回收后得到的DNA量無法滿足測序所需的最低要求,故測序結果并不完整。實驗最后總共得到13個18S rRNA基因序列,從這13個序列中篩選出 9個同源性相對最近的標準菌株,用ClustalX 2.0進行分析比較后,用Mega5.0軟件進行系統發育樹的構建,如圖4所示,在屬水平總共分為9個屬,包括Penicillium(青霉屬)、Aureobasidium(短柄霉屬)、Pyrenochata(棘殼菌屬)、Rhodocybella(紅蓋菇屬)、Vanderwaltozyma、Kazachstania、Cystofilobasidium、Saccharomyces(酵母菌屬),還有一株未被培養的優勢菌。屬于Penicillium(青霉屬)的菌株最多,為3株；Pyrenochaeta(棘殼菌屬)有2株；Saccharomyces(酵母菌屬)有2株；有一株是未被培養的菌株。

圖4 土壤真菌18S rRNA-DGGE優勢條帶系統進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of soil fungal 18S rRNA-DGGE dominant bands

3 討論

目前已發表的關于內蒙古地區土壤真菌的文章大多數為單一土壤類型的研究,如對荒漠土壤或部分林地土壤真菌的研究[14-17]。研究則是利用PCR-DGGE方法對內蒙古西部地區的不同土壤類型中的土壤真菌多樣性進行初步研究與分析,找到土壤類型及利用類型與真菌多樣性的關聯,為日后該地區土壤真菌的開發做好基礎。

在內蒙古西部地區,真菌的多樣性受土壤類型的影響較大,棕鈣土、石質土、栗鈣土的香農指數及豐富度相對較高,栗褐土、鹽土、草甸土則相對較低。棕鈣土在內蒙古西部地區分布較廣,鈣積作用強,表層有機質含量較多,栗鈣土的腐殖層相對棕鈣土更厚,有機質更多,相對肥沃,真菌資源較為豐富；栗褐土母質特征明顯,土壤表層有機質含量較低,多樣性指數較低；內蒙古的草甸土有很大一部分是鹽堿草甸土,鹽分含量高,故對真菌多樣性有較大影響,導致真菌多樣性指數低。內蒙古西部地區土壤真菌多樣性的差異,受地貌復雜、水資源短缺、沙漠化嚴重等眾多因素影響[18-20],可能導致結果差異較大。

研究發現在同一地區的相同類型的土壤中,土壤的利用方式對真菌的結構及多樣性影響較大,此外,內蒙古西部地區降雨量、溫度與地形等諸多因素都有很大的區別[21],可能導致不同地區的相同土壤類型的真菌結構差異很大。如在鄂爾多斯同一地區的灰鈣土中耕地的微生物種類比草地的微生物種類少,耕地的真菌條帶明顯比草地少,如圖3所示,12#為草地灰鈣土,6#、10#為耕地灰鈣土,9#為林地灰鈣土,草地真菌的多樣性要與耕地與林地相比更為豐富。內蒙古西部地區占地面積較大,土壤種類較多,再加上土壤的利用方式不同,另外,菌的多樣性受到各方面因素的制約,包括土壤的理化性質、重金屬污染等[22]都是真菌多樣性變化的直接或間接因素。

實驗最終得到兩個門Ascomycota(子囊菌門)與Basidiomycota(擔子菌門),共9個屬的真菌優勢條帶,分別為Penicillium(青霉屬)、Aureobasidium(短柄霉屬)、Pyrenochata(棘殼菌屬)、Rhodocybella(紅蓋菇屬)、Vanderwaltozyma、Kazachstania、Cystofilobasidium、Saccharomyces(酵母菌屬),還有一株未被培養的優勢菌。屬于Penicillium(青霉屬)的菌株最多,為3株；Pyrenochaeta(棘殼菌屬)有2株；Saccharomyces(酵母菌屬)有2株；有一株是未被培養的菌株。真菌優勢條帶基本都包括Ascomycota(子囊菌門)與Basidiomycota(擔子菌門),以上基本與張星星[23]、李浩[24]、張善利[25]的研究基本保持一致。賈美清等[16]在研究內蒙古荒漠草原土壤真菌時共發現14個屬的真菌,其中青霉屬的真菌占可培養真菌數的48.76%,這與研究中分離出的青霉屬比例相似。

研究發現土樣的各項理化性質指標,如含水量、pH與真菌的香農指數、豐富度之間的相關性并不顯著。寧夏沙漠地區分離到 7屬 44 種,土壤真菌數量表現為天然荒漠草原>固沙地>流沙[26]；李玲[27]在北方草地土壤真菌的研究中發現,土壤理化指標與真菌多樣性無相關性,土壤真菌種系型豐富度與土壤含水量、有機碳含量、全氮含量及全磷含量呈顯著正相關關系；余潮等[28]研究發現,除全磷含量以外,土壤理化指標和真菌生物量都對真菌群落結構的變化有明顯影響,其中起決定作用的理化因子為含水量、總有機碳含量和土壤容重?？梢?土壤部分理化指標是影響土壤真菌多樣性的重要指標。這與本文研究結果略有不符,可能是由于內蒙古西部地區獨特的地理條件以及氣候因素等原導因素致影響真菌多樣性的原因較多,另本文研究發現土壤類型與其利用方式也會對土壤真菌的多樣性產生較大影響,而上述研究人員的實驗結果是建立在單一土壤利用類型上的。

4 結論

利用PCR-DGGE方法對內蒙古西部地區土壤中的真菌多樣性進行了初步分析；發現內蒙古西部西區真菌資源較為豐富,其多樣性受土壤類型影響較大。優勢菌群包括Ascomycota(子囊菌門)與Basidiomycota(擔子菌門)。

真菌是與人類生產生活息息相關的一類菌群,研究成果為今后該地區土壤環境的改善及真菌資源的開發奠定基礎。